張純清，單鐵英，楊書良，袁 征

（河北工程大學醫(yī)學院：1.人體解剖學與組織胚胎學系；2.病理學系；3.生理學系，邯鄲056002）

枸杞多糖（lycium bararum polysaccharides，LBPs）是傳統(tǒng)中藥材枸杞的主要成分之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等6種單糖組成。近年來對LBPs的藥理作用進行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)LBPs具有調節(jié)機體免疫、抗腫瘤等功能［1－4］。LBPs的研究已成為當前熱門課題，但國內外還未見LBPs對人樹突狀細胞（dendritic cell，DC）成熟和功能影響的報道。本研究觀察LBPs誘導DC成熟和增強T細胞增殖作用，研究其具體作用機制，為進一步研究LBPs調節(jié)特異性免疫應答機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 新鮮人外周血購自北京市血庫，淋巴細胞分離液購自上海試劑二廠，rhGM－CSF、rhIL－2和rhIL－4購自德國R＆D公司，尼龍毛購自FENWAL USA，鼠抗人 MHCⅡ、CD86、CD83即用型二步法生物素檢測試劑盒（PV9000），F(xiàn)ITC標記二抗購自北京中山生物技術有限公司，LBPs購自美國泛華公司。

1.2實驗方法

1.2.1DC誘導培養(yǎng) 取正常人外周血200mL，以淋巴細胞分離液分離單個核細胞于培養(yǎng)皿培養(yǎng)2h后，取貼壁細胞即單核細胞，加 入 GM－CSF 1mL（1 000u/mL）、IL－4 1mL（500 u/mL）培養(yǎng)7d后，收獲的細胞加入終濃度為100μg/mL的LBPs，加入等量RPMI 1640作為對照；37℃培養(yǎng)48h后收集細胞。觀察DC形態(tài)變化。

1.2.2免疫細胞化學法檢測DC分子表達 取固定好的DC細胞涂片，DC純度為90%。用3%H2O2甲醇溶液室溫孵育5～10min，以消除內源性過氧化酶。蒸餾水沖洗，0.01MPBS（pH 7.3）浸洗3次，每次5min。0.1%Triton X－100室溫孵育5min。0.01MPBS（pH 7.3）浸洗3次，每次5min。滴加一抗（鼠抗人 MHCⅡ、CD86、CD83抗體），反應1h后，0.01M PBS（pH7.3）浸洗3次，每次5min。滴加PV9000試劑盒內試劑1，37℃孵育10～30min。用0.01MPBS（pH 7.3）浸洗3次，每次5min。滴加PV9000試劑盒內試劑2，37℃孵育10～30min。用0.01MPBS（pH 7.3）浸洗3次，每次5min。滴加0.05MTris－HCl（pH 7.6）浸泡5min。DAB顯色，顯色時間5～10min。用自來水充分沖洗，復染核后，脫水、透明、封片、光鏡觀察。

1.2.3T細胞的獲得 取同種異體外周血，按以上方法獲得單個核細胞于培養(yǎng)皿培養(yǎng)2h后，收集非貼壁細胞即為淋巴細胞，將3×107個/mL淋巴細胞注入尼龍毛柱，放入培養(yǎng)箱靜置1h。用培養(yǎng)液洗柱，洗下的即為T細胞。

1.2.4T細胞的激活和增殖 調節(jié)按以上方法獲得的T細胞濃度為2×105個/100μL，以每孔100μL加入96孔板，作為反應細胞。收集按以上方法獲得的兩組DC作為刺激細胞。調整DC濃度為2×103、1×104、2×104個/孔，分別與T細胞混合，總體積為每孔200μL，每組設5個復孔。培養(yǎng)120h，于最后18h加入10μL MTT（5mg/mL）離心，棄上清液，加入150μL二甲基亞砜（DMSO）。用酶標儀檢測OD值，并計算細胞增殖指數(shù)。增殖指數(shù)＝（實驗組OD值－反應細胞對照組OD值－刺激細胞對照組OD值）/反應細胞對照組OD值。

1.3統(tǒng)計學方法 所得數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，實驗結果以s表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1DC的體外誘導與培養(yǎng) 在倒置相差顯微鏡下可見正常人外周血分離的單核細胞在培養(yǎng)過程中體積逐漸增大，細胞形態(tài)由圓形變?yōu)槎狐c狀、蝌蚪狀、長梭形或不規(guī)則形，并向四周伸出不規(guī)則狀的突起。經(jīng)LBPs作用的DC呈懸浮狀生長，體積較大，大小不等，呈圓形，細胞表面有突起且在培養(yǎng)液中可擺動或伸縮。而經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)的DC對照組與培養(yǎng)前無明顯變化。

2.2LBPs對DC MHCⅡ、CD86、CD83等分子表達的影響經(jīng)LBPs誘導培養(yǎng)的DC分子表達有明顯變化（MHCⅡ＋、CD86＋、CD83＋），而經(jīng)RPMI 1640培養(yǎng)的DC分子表達與培養(yǎng)前變化不明顯（表1）。

表1 兩組培養(yǎng)2d后DC分子表達的圖像分析結果（s）

表1 兩組培養(yǎng)2d后DC分子表達的圖像分析結果（s）

分子表達 實驗組 MOD（n＝20）對照組MOD（n＝20）P 0.05 CD86 0.186 0±0.004 6 0.012 8±0.003 2 ＜0.05 CD83 0.192 6±0.003 8 0.025 3±0.001 9 ＜0.05 MHCⅡ 0.287 4±0.014 5 0.027 9±0.016 3 ＜

2.3T細胞增殖實驗結果 培養(yǎng)液中有LBPs時DC激發(fā)T細胞增殖的能力進一步增強（P＜0.05），且在此濃度范圍內隨著DC濃度增加T細胞增殖指數(shù)也增加（表2）。

表2 T細胞增殖指數(shù)（s，n＝10）

表2 T細胞增殖指數(shù)（s，n＝10）

DC濃度 實驗組 對照組P 2×103 0.362±0.019 0.213±0.011 ＜0.05 1×104 0.486±0.018 0.296±0.013 ＜0.05 2×104 0.667±0.014 0.412±0.009 ＜0.05

3 討 論

腫瘤患者在接受放、化療時，射線和藥物對機體的免疫系統(tǒng)有抑制作用，致使機體的免疫功能進一步下降，影響了治療效果并可導致一些不良反應，所以解決腫瘤患者免疫功能低下問題成為腫瘤治療非常關鍵的環(huán)節(jié)。最近國內外學者提出生物反應調節(jié)劑（biological responsemodifier，BRM）的概念，強調在腫瘤放、化療及手術治療的同時應用BRM，不但能提高患者的免疫功能，還可減輕上述治療對免疫系統(tǒng)及造血系統(tǒng)的損害，從而提高治療效果。在我國中藥取自天然，來源廣泛，容易獲得，不良反應小。因此從中藥中提取有效成分作為BRM顯示其明顯優(yōu)勢。為此作者對LBPs免疫調節(jié)作用進行了研究，顯示了很好的免疫促進作用，為進一步研究其作用機制，作者進一步研究了LBPs對外周血巨噬細胞增殖及功能的影響。

LBPs已經(jīng)很多實驗證明具有調節(jié)免疫功能和抗腫瘤的功能。已有文獻報道了TBPs對巨噬細胞、T淋巴細胞、NK細胞的影響［2］，但對DC的表型和功能的影響卻未見報道。

DC是一種重要的專職抗原提呈細胞，對啟動輔助性T細胞和細胞毒性T細胞的免疫應答具有重要作用［3－5］。imDC俘獲和處理外源性抗原后成為mDC，通過主要組織相容性復合物（MHC）分子提呈抗原多肽激活T細胞，啟動特異性免疫應答。有實驗證明，DC的成熟狀態(tài)與其功能有關，imDC有較強的抗原攝取和加工能力［6－10］。MHCⅡ、CD86、CD83分子是與DC抗原提呈作用密切相關的分子，也是與DC對T細胞的激活作用密切相關的分子。本實驗結果顯示，經(jīng)過LBPs刺激作用后的DC，MHCⅡ、CD86、CD83的表達水平明顯增高，且DC激活T細胞能力及T細胞增殖能力增強，說明LBPs能誘導DC成熟，同時刺激T細胞增殖能力增強。

本實驗從DC形態(tài)、表面抗原、抗原提呈功能方面顯示了LBPs對人DC成熟的影響。LBPs促進DC成熟的機制是什么、是否與多糖的種類、結構、劑量有關等尚有待進一步研究。

［1］Gon GH，Shen P，Jin L，et al.Therapeutic effects of Lycium barbarum polysaccharide（LBP）on irradiation or chemotherapy－induced myelosuppressive mice ［J］.Cancer Biother Radiopharm，2007，20（2）：155.

［2］Gan L，Zhan GSH，Yan GXL，et al.Immunomodulation and ant itumor activity by apolysaccharide protein complex from Lyciumbarbarum［J］.Int Immuno Pharmacol，2006，4（4）：563.

［3］古賽，蔣小黎.枸杞多糖治療酒精性脂肪肝大鼠的實驗研究［J］.重慶醫(yī)學，2007，36（1）：60.

［4］方曉松，周顰.注射用黃芪多糖治療原發(fā)性肝癌的療效觀察［J］.重慶醫(yī)學，2009，38（8）：935.

［5］Ke－jian ZHU.Dendritic cell and autoimmune diseases［J］.Journal of Zhe jiang University：Medical Sciences，2003，32（1）：81.

［6］Lanzavecchia A，Sallusto F.Regulation of T cell immunity by dendritic cells［J］.Cell，2004，106（3）：263.

［7］Go ldman R.Characteristics of the－glucan receptor of murine macrophages［J］.Exp Cell Res，1988，17（4）：481.

［8］謝裕安，羅小玲，梁安民，等.樹突狀細胞介導的肝癌免疫治療實驗研究［J］.廣西醫(yī)學，2005，27（8）：1133.

［9］唐國全.樹突狀細胞疫苗的研究與腫瘤的免疫治療［J］.廣西醫(yī)學，2006，28（12）：1930.

［10］劉劍勇.樹突狀細胞與肝癌治療研究進展［J］.廣西醫(yī)學，2004，26（11）：1578.