韓曉鵬，李新源，魏登文，苗鵬程，孫少華

（1.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院普外科，甘肅730050；2.蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，甘肅730000）

隨著創(chuàng)傷的日益增加，腎臟損傷的發(fā)生率亦有明顯增加趨勢(shì)。腎臟損傷在泌尿系統(tǒng)損傷中僅次于尿道損傷而居第2位。有關(guān)創(chuàng)傷免疫的研究日益受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注。本文對(duì)外源性腎上腺髓質(zhì)素（ADM）對(duì)腎臟機(jī)械性損傷腫瘤壞死因子－α（TNF－α）表達(dá)的影響進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討外源性ADM是否具有調(diào)節(jié)腎臟損傷后免疫失衡的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)Wistar大鼠由蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物合格號(hào)：醫(yī)動(dòng)字14－006），雌雄各半，體質(zhì)量（210±30）g，鼠齡3個(gè)月，分籠飼養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 （1）固體石蠟、10%福爾馬林、蘇木素復(fù)染液、梯度乙醇、二甲苯、40mg/L水合氯醛、蒸餾水、去離子水等由蘭州大學(xué)法醫(yī)學(xué)教研室提供；（2）腎上腺髓質(zhì)素（ad－renomedullin Rat1－50，ADM）購(gòu)自美國(guó) CALBIOCHEM 公司，貨號(hào)121703。TNF－α、TNF－β、TNFR一抗及SABC免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3主要儀器 （1）生物撞擊儀：自行研制［1］；（2）光學(xué)顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)：日本Olympus公司；（3）計(jì)算機(jī) Mias圖像分析系統(tǒng)：四川大學(xué)圖像圖形研究所；（4）切片機(jī)：德國(guó)AQ820；（5）電子分析天平：上海天平儀器廠；（6）微量加樣器（20～200 μL、0～10μL）：Labsystem 公司；（7）冰箱、恒溫電烤箱、微波爐、濕盒等。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將104只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組（8只）、創(chuàng)傷組（32只）、傷前給藥組（32只）、傷后給藥組（32只）。后3組分別在打擊后1、6、12、24h各處死8只。

1.5ADM的配制與使用 ADM使用前先用0.9%生理鹽水稀釋成50nmol/L母液，置于－20℃保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)按照0.1 nmol/kg計(jì)算每只動(dòng)物所需的量，再以0.9%生理鹽水稀釋為0.5mL終體積腹部注射即可。

1.6實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟損傷模型的制作 建立腎臟Ⅰ級(jí)損傷動(dòng)物模型及采集標(biāo)本，動(dòng)物不經(jīng)任何麻醉處理，采用臥位將其四肢固定于打擊臺(tái)上，自45cm高度處釋放160g鐵質(zhì)打擊錘以自由落體下降直接打擊脊肋區(qū)，分別間接打擊雙側(cè)腎臟造成腎臟Ⅰ級(jí)損傷（根據(jù)美國(guó)創(chuàng)傷外科學(xué)會(huì)器官損傷標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)制定的腎臟損傷標(biāo)準(zhǔn)［2］）。傷前給藥組于打擊前10min及傷后給藥組于打擊后10min均腹部注射 ADM 0.1nmol/kg，各組動(dòng)物均于8∶00采用快速心臟采血法處死。處死前仰臥固定，用水合氯醛（3mg/kg）深度麻醉，剪去胸腹部毛發(fā)，消毒，開胸、腹直視抽取心臟血致死。將采集到的血液迅速移入抗凝管中并輕輕搖勻備用，解剖及采血過(guò)程控制在2h以內(nèi)。各組腎臟經(jīng)HE染色病理組織切片觀察后符合腎臟Ⅰ級(jí)損傷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)美國(guó)創(chuàng)傷外科學(xué)會(huì)器官損傷標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)指定的腎臟標(biāo)準(zhǔn)選擇打擊強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)選擇Ⅰ級(jí)損傷標(biāo)準(zhǔn)的致傷強(qiáng)度建立動(dòng)物模型，鏡下觀察選擇標(biāo)準(zhǔn)是組織中不出現(xiàn)出血灶，但有紅細(xì)胞管型。

1.7組織的處理 迅速解剖動(dòng)物取下腎臟標(biāo)本，10%甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后，常規(guī)切片（4μm），HE染色和免疫組化染色觀察。

1.8免疫組化過(guò)程 （1）采用SABC法，將防脫片處理過(guò)的組織撈片；（2）切片于62℃烤片12h，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水；（3）熱修復(fù)抗原，將切片放入有枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）的容器中，置微波爐中加熱，中低火持續(xù)2min，取出容器冷卻至室溫；（4）用蒸餾水對(duì)切片清冼1～2次；（5）PBS洗3次，每次2min；（6）H2O2消化5～20min；（7）在室溫下用山羊血清封閉20min；（8）一抗（兔抗大鼠 TNF）4 ℃過(guò)夜；（9）0.01 mmol/L PBC漂洗3次，每次2min；（10）室溫下（20～30℃）生物素化羊抗兔IgG（二抗）20min；（11）0.01mmol/L PBC漂洗3次，每次2min；（12）室溫下（20～30℃）SABC 20min；（13）0.01mmol/L PBC 漂洗3次，每次2min；（14）DAB顯色12 min；（15）蘇木素復(fù)染；（16）脫水（同 HE染色中的相應(yīng)處理）；（17）透明（同HE染色中的相應(yīng)處理）；（18）封片（陰性對(duì)照用PBS代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照采用預(yù)實(shí)驗(yàn)中表達(dá)較好的組織）。

1.9陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn) 在高倍視野下出現(xiàn)棕黃色顆粒，特異性分布于細(xì)胞胞漿、胞核或胞膜。

1.10圖像采集分析方法 根據(jù)Kraan等標(biāo)準(zhǔn)略做修改，采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分別對(duì)免疫組化染色切片SAB中免疫組化染色進(jìn)行計(jì)量分析。在開機(jī)20min后，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)在10倍物鏡下采集圖像，從每張切片中隨機(jī)選取帶有1～2個(gè)近皮質(zhì)腎小球的區(qū)域，作為采集圖像標(biāo)準(zhǔn)。在該視野中選取5個(gè)顯色較好且非特異性背景染色控制良好的面積近似的腎小管區(qū)域進(jìn)行平均黑度值測(cè)量。數(shù)據(jù)導(dǎo)出為Excel格式。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析及處理數(shù)據(jù)，以s表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

傷前給藥組于傷后1、12h處于高表達(dá)水平，傷后6h低表達(dá)，且較該時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)傷組明顯降低（P＜0.05），傷后24h接近對(duì)照組水平，其余各時(shí)間點(diǎn)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。傷后給藥組于傷后1h明顯低于該時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)傷組和傷前給藥組（P＜0.01，P＜0.01），傷后24h其表達(dá)明顯高于傷后1h（P＜0.01），其余時(shí)間點(diǎn)之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。創(chuàng)傷組各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較及各時(shí)間點(diǎn)之間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1、插頁(yè)Ⅱ圖1）。

圖1 各組大鼠腎組織TNF－α的表達(dá)（SABC染色×200）

表1 各組大鼠腎組織TNF－α陽(yáng)性表達(dá)（s）

表1 各組大鼠腎組織TNF－α陽(yáng)性表達(dá)（s）

▲：與創(chuàng)傷組傷后1h比較，F(xiàn)＝9.690，P＜0.05；■：與創(chuàng)傷組傷后6h比較，F(xiàn)＝4.365，P＜0.05；＃：與傷前給藥組同時(shí)間點(diǎn)比較，F(xiàn)＝12.236，P＜0.05。

組別 n TNF－α（黑度值）正常對(duì)照組傷后1h 8 120.040 4±8.082 3傷后6h 7 121.880 5±9.181 6傷后12h 8 111.336 9±6.657 6傷后24h 8 113.460 7±7.377 8傷前給藥組傷后1h 8 114.558 7±6.212 0傷后6h 7 107.335 9±6.305 6■傷后12h 8 116.827 9±3.923 0傷后24h 7 111.894 9±8.820 8傷后給藥組傷后1h 7 103.388 8±4.585 0▲＃傷后6h 8 112.905 0±10.864 2傷后12h 6 111.775 6±6.794 7傷后24h 8 117.575 1±5.219 7

3 討 論

ADM是于1993年從人嗜鉻細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)一種由52個(gè)氨基酸殘基組成的活性肽［3－5］，其具有廣泛的生物學(xué)作用：（1）可抑制致炎因子釋放；（2）有細(xì)菌脂多糖存在時(shí)能降低肺泡巨噬細(xì)胞白細(xì)胞趨化物分泌水平；（3）可提高IL－6而降低TNF－α的分泌；（4）降低炎性滲出；（5）擴(kuò)張血管，增加管壁通透性，增強(qiáng)IL－6誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞聚集；（6）對(duì)炎癥血管反應(yīng)具有抑制作用。有研究顯示，創(chuàng)傷性炎癥誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生免疫源性降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP），可負(fù)性調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能；ADM屬于CGRP家族，具有炎癥調(diào)節(jié)作用，而致炎因子又可促使ADM自分泌而發(fā)揮作用。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，TNF－α與缺血再灌注損傷密切相關(guān)。TNF－α主要是由激活的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。TNF－α是細(xì)胞因子家族中最強(qiáng)效的炎癥介質(zhì)，通過(guò)與2種特定的膜結(jié)合受體——TNF受體1和TNF受體2結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。TNF－α大量表達(dá)后可通過(guò)直接的細(xì)胞毒作用，收縮血管以降低腎臟血流及聚集中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等，導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡、腎小球纖維蛋白沉積、清蛋白濾過(guò)增加、濾過(guò)率下降、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等，而這些因素可進(jìn)一步加重腎臟損傷。TNF－α還可能進(jìn)一步導(dǎo)致缺血再灌注損傷后出現(xiàn)腎臟失去功能和細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，創(chuàng)傷后1、6hTNF－α表達(dá)均高于對(duì)照組，并于6h達(dá)到峰值，12、24hTNF－α表達(dá)降低并接近對(duì)照組。說(shuō)明TNF－α在創(chuàng)傷早期即參與了腎組織炎癥的急性期反應(yīng)并加重?fù)p傷。TNF－α可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附因子，增強(qiáng)白細(xì)胞與之黏著，促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集和激活間質(zhì)釋放蛋白水解酶誘發(fā)炎癥反應(yīng)［5］。TNF－α可以刺激單核巨噬細(xì)胞和其他類型的細(xì)胞分泌IL－1、IL－6、TNF－α、IL－2等炎性細(xì)胞因子以放大或間接增強(qiáng)其本身的效應(yīng)，這些效應(yīng)加重了創(chuàng)傷局部的炎癥反應(yīng)。另一方面滲出的炎性細(xì)胞及其釋放的蛋白水解酶促進(jìn)了創(chuàng)傷壞死組織的吞噬和分解，有利于壞死組織的清除和創(chuàng)傷的修復(fù)，減少TNF－α的釋放，故表現(xiàn)在本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)傷組中12、24hTNF－α表達(dá)降低并接近對(duì)照組。創(chuàng)傷組各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較及各時(shí)間點(diǎn)之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示TNF－α參與炎癥的過(guò)程既有放大本身的效應(yīng)，又可間接地減少自身的釋放。

傷前給藥組TNF－α表達(dá)于傷后1、12h處于高表達(dá)水平。傷后6h低表達(dá)，且較該時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)傷組明顯降低（P＜0.05），傷后24h接近對(duì)照組水平，其余各時(shí)間點(diǎn)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血循環(huán)中ADM以20min的半衰期 迅速代謝［6］。傷前10min注射，外源性ADM剛好處于半衰期內(nèi)，與機(jī)體遭受創(chuàng)傷時(shí)產(chǎn)生的內(nèi)源性ADM一起對(duì)創(chuàng)傷器官發(fā)揮了良好的保護(hù)作用。傷前給藥組TNF－α在1、6h的表達(dá)低于創(chuàng)傷組同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)，并與6h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證實(shí)了ADM能降低巨噬細(xì)胞白細(xì)胞趨化物分泌水平，降低TNF－α分泌。此效應(yīng)及時(shí)地下調(diào)了急性創(chuàng)傷后TNF－α的級(jí)聯(lián)放大作用，避免創(chuàng)傷對(duì)腎臟組織的過(guò)度損害。

傷后給藥組TNF－α的表達(dá)于傷后1h明顯低于該時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)傷組和傷前給藥組（P＜0.01）。說(shuō)明創(chuàng)傷后注射ADM可明顯抑制TNF－α在傷后1h的表達(dá)，且其效果優(yōu)于創(chuàng)傷前給藥。傷后24hTNF－α表達(dá)明顯高于傷后1h（P＜0.01）。分析其原因可能是傷后24h外源性ADM基本已完全代謝，僅有內(nèi)源性ADM發(fā)揮效應(yīng)。

血漿中ADM主要來(lái)源于血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）和血管平滑肌細(xì)胞（VSMC），正常人血漿ADM濃度較低，大多為具有免疫反應(yīng)性的ADM－gly，它是ADM的一種中間形式，這也反映了 ADM 在組織中的產(chǎn)生過(guò)程［7］。IL－1β、TNF－α、脂 多糖（LPS）、內(nèi)皮素－1（ET－1）、血管緊張素－Ⅱ均可刺激 VSMC分泌ADM，而ADM能降低TNF－α的分泌，抑制TNF－α的級(jí)聯(lián)放大作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與多數(shù)學(xué)者觀點(diǎn)相吻合。

TNF－α是一種具有多種生物學(xué)功能的炎性細(xì)胞因子，參與了腎臟損傷的炎癥發(fā)展過(guò)程，隨著對(duì)TNF－α研究的深入，可能為揭示腎臟損傷的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，并為治療腎臟損傷性疾病提供新的手段，如采用控制TNF－α產(chǎn)生量、中和TNF－α觸發(fā)的細(xì)胞反應(yīng)來(lái)防止TNF－α所引起的組織損傷，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)直接在炎癥部位使TNF－α等炎癥介質(zhì)失去生物學(xué)活性等。

［1］蒙伶俐，孫少華，張軍榮，等.經(jīng)體表創(chuàng)傷后腎臟組織中缺氧誘導(dǎo)因子－1α表達(dá)的調(diào)控［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26（14）：1311.

［2］Moore EE，Shackford SR，Pachter HL，et al.Organ injury scaling：spleen，liver，and kidney［J］.J Trauma，1989，29：1664.

［3］Liu J，Chen M，Wang X.Calcitonin gene－related peptide inhibits lipopolysaccharide－induced interleukin 12release from mouse peritoneal macrophages，mediated by the cAMP pathway［J］.Immunology，2000，101（1）：61.

［4］蔡大勇，唐朝樞.腎上腺髓質(zhì)素的抗感染和炎癥調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2005，21（3）：614.

［5］Noiri E，Nakao A.Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2001，281：948.

［6］Betowski J，Jamroz A.Adrenomedullin－what do we know 10years since its discovery［J］.Pol J Pharmacol，2004，56（1）：27.

［7］Kitamura K，Kato J，Kawamoto M，et al.The intermediate form of glycine－extended adrenomedullin is the major circulating molecular form in human plasma［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，244（2）：551.