鄒志鵬，馮 麗，許萬(wàn)福，鄧 凡

（南方醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，廣州510515）

蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）屬于一類新的結(jié)合二酰基甘油（DAG）和佛波脂（PMA）的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，目前已鑒定出3種PKD亞型（PKD1、2、3），分別參與細(xì)胞高爾基體反面膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞存活、遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)［1－2］。PKD1在低侵襲型前列腺癌細(xì)胞LNCaP中表達(dá)水平較高，不僅如此PKD1可磷酸化E－鈣粘素（E－Cadherin），從而增強(qiáng)LNCaP的聚集，減弱其遷移能力［3］。作者最近的研究顯示，在高侵襲型前列腺癌細(xì)胞PC－3中PKD3的表達(dá)水平明顯高于LNCaP，在LNCaP中過表達(dá)PKD3可抑制PMA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換；反之敲低（knockdown）PC－3中的內(nèi)源性PKD3可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，也可導(dǎo)致 G0～1期阻滯，從而抑制 PC－3增殖［4］。而在非小細(xì)胞肺癌A549中PKD3可通過基質(zhì)金屬蛋白酶－2（MMP－2）促進(jìn)腫瘤的遷移（尚未發(fā)表）。提示PKD3可能通過不同的機(jī)制而促進(jìn)細(xì)胞的遷移、侵襲。

尿激酶型纖溶酶原激活物受體（urokinase－type plasminogen activator receptor，uPAR）隸屬于Ly－6蛋白超家族，與其配體uPA前體結(jié)合后導(dǎo)致uPA的激活，從而切割纖溶酶原產(chǎn)生有活性的纖維蛋白溶酶，繼而降解細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)激活一系列 MMP－2，如 MMP－3、MMP－9及 MMP－13，在腫瘤的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用［5－6］。uPAR的表達(dá)受多種轉(zhuǎn)錄因子如AP1、HIF1－alpha及SP1調(diào)控，同時(shí)有研究表明，β－連環(huán)蛋白－TCF4信號(hào)通路可通過AP1間接上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中uPAR的表達(dá)［7］。

盡管PKD3與uPAR均可促進(jìn)腫瘤的遷移，但腫瘤遷移和侵襲中PKD3及uPAR的相互調(diào)控關(guān)系尚未闡明。本研究擬以人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293為研究模型，探求PKD3對(duì)于uPAR的調(diào)控作用及其初步機(jī)制，為闡明PKD3調(diào)控細(xì)胞遷移及腫瘤遷移和侵襲的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM液體培養(yǎng)基以及胎牛血清購(gòu)自Hyclone，轉(zhuǎn)染試劑 Hilymax購(gòu)自日本同仁化工，丙烯酰胺、SDS、CHPAS及甘氨酸等超純生化試劑均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，焦磷酸鈉、氟化鈉和釩酸鈉購(gòu)自Sigma，pEGFP－C2、pEGFPPKD3及pEGFP－β－連環(huán)蛋白質(zhì)粒由美國(guó)匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dr.Wang Q.Jane惠贈(zèng)，Rabbit Anti－PKD3Polyclonal Antibody（A300－319A）購(gòu)自 Bethyl Laboratories，Mouse Anti－Beta－Catenin Monoclonal Antibody（SC－7963）購(gòu)自Santa Cruz，逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自復(fù)能基因公司（FULGENE），實(shí)時(shí)定量PCR相關(guān)基因的引物由上海英俊公司設(shè)計(jì)和合成，其序列為 PKD3 正 向 引 物：5′－ACCCGTCCCACGATATGTCAGTA－3′，PKD3 反 向 引 物：5′－CAGCGTTTATGGCAGTTGAATTTG－3′；uPAR 正 向 引 物：5′－GGTGACGCCTTCAGCATGA－3′，uPAR 反 向 引 物：5′－CCCACTGCGGTACTGGACAT－3′；內(nèi)參照基因?yàn)榇吸S嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1），HRPRT1正向引物：5′－TGACACTGGCAAAACAATGCA－3′，HRPT1反向引物：5′－GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT－3′。

1.2細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人胚腎上皮細(xì)胞系HEK293細(xì)胞由本室保存，培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100ng/mL鏈霉素）中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1實(shí)時(shí)定量PCR HEK293細(xì)胞按2.5×105/mL密度接種于6孔板中，24h后分別轉(zhuǎn)入pEGFP－C2及pEGFPPKD3，24h后血清饑餓12h，繼以100nM PMA刺激24h，上述4組分別記為CTL、CTL＋PMA、PKD3、PKD3＋PMA組。轉(zhuǎn)染過程按照Hilymax說明書進(jìn)行。

1.3.2免疫沉淀 將HEK293細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿中，24h后達(dá)到約50%融合密度，此時(shí)分別轉(zhuǎn)染pEGFP－C2（CTL）或pEGFP－Beta－Catenin（Beta－Catenin），24h后血清饑餓16h，以DMSO或100nM PMA刺激1h后裂解上述4組細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行免疫沉淀分析。

1.4總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 總RNA提取按照TRIZOL試劑盒說明書進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄按照復(fù)能基因（FULGENE）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 按照復(fù)能基因（FULGENE）實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性10min，95℃、10s，58 ℃、15s，72 ℃、20s，40個(gè) 循 環(huán)，72 ℃延伸10 min，72℃采集熒光信號(hào)。以Beta 2－微管蛋白（B2M）作為內(nèi)參照基因，并采用相對(duì)定量法進(jìn)行定量。相對(duì)表達(dá)量＝2－△△Ct［8］，△Ct＝目的基因平均Ct值－內(nèi)參照基因平均Ct值，△△Ct＝實(shí)驗(yàn)組△Ct－對(duì)照組△Ct。

1.6免疫沉淀與免疫印跡

1.6.1免疫沉淀 向每個(gè)皿中加入預(yù)冷IP裂解緩沖液（40 mM Hepes，pH 7.5，120mM NaCl，1mM EDTA，10mM 焦磷酸鈉，10mMβ－甘油磷酸鈉，50mM 氟化鈉，1.5mM 釩酸鈉，0.3%CHAPS）500μL（約1×107個(gè)/mL）冰上裂解30min，期間搖動(dòng)平皿幾次以促使裂解液與細(xì)胞充分接觸。裂解后的細(xì)胞經(jīng)4℃、12 000×g離心10min，取上清液標(biāo)為全細(xì)胞裂解液。蛋白定量后取500μg全細(xì)胞裂解液與相應(yīng)的抗體4℃孵育過夜，孵育完成后加入蛋白A/G－瓊脂糖樹脂（根據(jù)抗體屬性選擇）4℃、2h，孵育完畢后用裂解緩沖液漂洗樹脂3次，漂洗緩沖液（50mM Hepes，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，0.3CHAPS）漂洗2次，每管加入40μL 2×SDS上樣緩沖液100℃加熱5min，12 000×g離心5min，取上清液進(jìn)行SDSPAGE或者置－70℃保存。

1.6.2免疫印跡 收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解30 min，于4℃、12 000×g離心20min，取上清液，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS－PAGE電泳并轉(zhuǎn)位到PVDF膜上，最后采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。具體步驟及試劑配方參見參考文獻(xiàn)［9］。

2 結(jié) 果

2.1Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)證實(shí)HEK293細(xì)胞中PKD3過表達(dá) GFP－PKD3轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中PKD3明顯過表達(dá)，而pEGFP－C2轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中未見外源性PKD3表達(dá)，而且有、無(wú)PMA刺激的GFP－PKD3轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞PKD3表達(dá)一致（圖1A、1B）。

圖1 Western blot和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2過表達(dá)PKD3增強(qiáng)HEK293細(xì)胞中PMA誘導(dǎo)的uPAR表達(dá) 在無(wú)PMA刺激時(shí)過表達(dá)PKD3即可明顯上調(diào)HEK293細(xì)胞中uPAR轉(zhuǎn)錄水平，而PMA刺激則明顯增強(qiáng)（圖2）。

圖2 在HEK293中過表達(dá)PKD3可增加PMA刺激誘導(dǎo)的UPAR轉(zhuǎn)錄

圖3 HEK293細(xì)胞中PMA刺激誘導(dǎo)PKD3與β－連環(huán)蛋白相互作用。

2.3在HEK293細(xì)胞中PMA刺激誘導(dǎo)PKD3與β－連環(huán)蛋白結(jié)合 在HEK293中過表達(dá)PKD3可明顯增強(qiáng)PMA刺激誘導(dǎo)uPAR轉(zhuǎn)錄（圖2），而在結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中過表達(dá)β－連環(huán)蛋白可明顯上調(diào)uPAR mRNA和蛋白水平［7］，因此作者設(shè)想PKD3直接或間接通過β－連環(huán)蛋白上調(diào)uPAR轉(zhuǎn)錄活性。如圖2所示，過表達(dá)β－連環(huán)蛋白的HEK293細(xì)胞在PMA刺激時(shí)PKD3與β－連環(huán)蛋白有明顯的共沉淀現(xiàn)象，提示PMA可誘導(dǎo)PKD3與β－連環(huán)蛋白相互作用。有趣的是，即使在未轉(zhuǎn)染GFP－β－連環(huán)蛋白CTL組中，免疫沉淀復(fù)合物中也檢測(cè)到了約130×103的條帶（NS），與GFP－β－連環(huán)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量極為接近。而在未做免疫沉淀的全細(xì)胞裂解液（Input）中，β－連環(huán)蛋白抗體同樣檢測(cè)到了此條帶，提示該條帶很可能代表一種可與PKD3及β－連環(huán)蛋白免疫復(fù)合物結(jié)合的非特異蛋白（圖3）。

3 討 論

作者前期研究證實(shí)，PKD3不僅調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖和存活［4］，還促進(jìn)非小細(xì)胞癌A549的遷移和侵襲（尚未發(fā)表）。uPAR與uPA前體結(jié)合后可激活uPA的活性，激活纖維蛋白溶酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，激活一系列基質(zhì)金屬蛋白酶，從而促進(jìn)包括前列腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的遷移和侵襲［5－6］。本研究表明，單純過表達(dá)PKD3即可上調(diào)HEK293中uPAR的轉(zhuǎn)錄水平，而以PMA激活PKD3活性后uPAR的轉(zhuǎn)錄水平更是明顯上調(diào)，提示PKD3很可能通過上調(diào)uPAR的表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞的遷移和侵襲。

PKD3通過什么途徑上調(diào)uPAR的表達(dá)呢？前期有研究提示，β－連環(huán)蛋白－TCF4信號(hào)通路可通過AP1間接上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中uPAR的表達(dá)［7］，而近期有文獻(xiàn)報(bào)道，PKD1可磷酸化β－連環(huán)蛋白并使之從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜并與ECadherin結(jié)合，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附，抑制其侵襲［10－11］。鑒于PKD1與PKD3的同源性和可能存在的功能拮抗，本研究假設(shè)PKD3可磷酸化β－連環(huán)蛋白并使之轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，從而間接激活uPAR的轉(zhuǎn)錄。與之相符，PMA刺激HEK293細(xì)胞可誘導(dǎo)PKD3與β－連環(huán)蛋白直接結(jié)合，為進(jìn)一步驗(yàn)證上述假設(shè)提供了有效證據(jù)。

在隨后的研究中，作者擬采用激光共聚焦顯微鏡探求在不同細(xì)胞系（HEK293及前列腺癌細(xì)胞系）中及不同條件下PKD3與β－連環(huán)蛋白之間可能存在的共定位關(guān)系，并以亞細(xì)胞組分分離（subcellular fractionation）研究 PKD3及β－連環(huán)蛋白應(yīng)對(duì)各種刺激時(shí)在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核之間的穿梭情況 ，以進(jìn)一步證實(shí)PKD3與β－連環(huán)蛋白之間的相互作用，并定位其相互作用的區(qū)域。同時(shí)作者還將在不同的前列腺癌細(xì)胞系中以報(bào)告基因Topflash驗(yàn)證PKD3的表達(dá)和活性是否調(diào)控TCF4的轉(zhuǎn)錄活性。

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