屈 強，史 忠，粟永萍△

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川646000；2.第三軍醫(yī)大學(xué)全軍復(fù)合傷研究所，重慶400038）

近年來文獻報道嚴重創(chuàng)傷后機體糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptors，GR）與創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)紊亂的發(fā)生、繼發(fā)性全身損害密切相關(guān)，而N－甲基－D－天門冬氨酸受體（N－Methyl－D－Asparate receptor，NR）在糖皮質(zhì)激素抵抗（glucocorticoid resistant，GCR）的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要作用。有研究觀察到使用NR拮抗劑氯胺酮等可明顯抑制小鼠嚴重燒傷模型中GR的下調(diào)［1］，其機制不清。而NR拮抗劑和咪唑安定等苯二氮卓受體（GABA）激動劑已被大量研究證實具有腦保護作用。NR功能亞單位1（NR1）具有NR的電生理和藥理學(xué)特性。因此如果能夠從NR1入手，進一步研究GCR在應(yīng)激中變化的中樞機制，并設(shè)法進行調(diào)控，將有可能為揭示嚴重創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)紊亂以及防治嚴重繼發(fā)性全身損害的發(fā)生提供重要的理論與實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1創(chuàng)傷模型制作及分組 取雄性KM小鼠150只（第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供），體質(zhì)量為22～26g，用BIM－Ⅲ型小型多功能動物撞擊機制作清醒小鼠閉合性嚴重顱腦損傷（TBI）模型［2］。將其隨機分為5組，每組30只。假致傷組（J組）不作撞擊，僅固定與其他組相似時間；致傷對照組（N組）于致傷后10～15min腹腔注射0.9%生理鹽水0.01mL/g；致傷后氯胺酮治療組（K組）于致傷后10～15min腹腔注射氯胺酮（上海市第一制藥廠生產(chǎn)）10mg/kg，即注射0.01%氯胺酮藥液0.01mL/g；致傷后咪唑安定治療組（M組）于致傷后10～15min腹腔注射咪唑安定（徐州恩華藥業(yè)生產(chǎn)）0.3mg/kg，即注射0.003%咪唑安定藥液0.01mL/g；致傷后復(fù)合用藥治療組（F組）于致傷后10～15min腹腔注射氯胺酮10mg/kg和咪唑安定0.3mg/kg，即注射0.003%咪唑安定及0.01%氯胺酮復(fù)合藥液0.01mL/g。

1.2標本采集 各組均于致傷后30min及2、8、24、48、72h各斷頭處死5只小鼠，經(jīng)頸動脈收集血液分離血清，用孔徑0.22μm微孔濾器除菌后放置于－70℃冰箱保存。收集血液后，迅速取小鼠肝臟組織，冰上分離海馬，均置于液氮保存。小鼠肝臟、海馬組織各100mg分別加入1mL RIPA組織細胞裂解液（上海申能博彩生物有限公司生產(chǎn)），按說明書操作，提取肝臟總蛋白，采用Bradford法測定蛋白濃度，置于－70℃冰箱備用。

1.3血清 TNF－α、IL－1β的測定 TNF－α、IL－1β均采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（晶美生物工程有限公司生產(chǎn)），操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.4GR/NR1Western blot分析 每個樣本取40μg蛋白，加入等體積2×SDS－PAGE上樣緩沖液，混合，99℃變性5min后冰浴，微量加樣器上樣。經(jīng)6%聚丙烯酰胺100v恒壓電泳后，80mA電轉(zhuǎn)印至PVDF膜（過夜），5%牛奶蛋白37℃封閉3h，加入1∶400稀釋GR/NR1一抗（兔抗小鼠GR/NR1，Santa cruz美國）37℃孵育3h，PBST洗膜后加入單過氧化酶標記二抗（山羊抗兔IgG，博士德）37℃孵育3h，PBST洗膜后加入DAB顯色，采用Geldoc2000凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad公司 美國）成像和分析處理，蛋白含量以O(shè)Du×面積表示。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均以s表示，用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理，組間比較采用配對樣本t檢驗，組內(nèi)采用單因素方差分析，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組血清中TNF－α含量測定結(jié)果 各組TNF－α含量于致傷后30min均明顯增高（P＜0.01），8h達高峰（P＜0.01）；J組明顯低于其他各組（P＜0.01）；N組明顯高于其他各組（P＜0.01），但24h后各組間差異逐漸縮?。籉組在傷后8h明顯低于其他各組（P＜0.01），48h明顯低于 K組（P＜0.01），見表1。

2.2各組血清中IL－1β含量測定結(jié)果 各組IL－1β含量于致傷后30min均明顯增高（P＜0.01），24h達高峰（P＜0.01）；J組明顯低于其他各組（P＜0.01）；2h后N組明顯高于其他組（P＜0.01）；F組在傷后8h明顯低于其他各組（P＜0.01）；但24h后各組間差異逐漸縮小，見表2。

表1 各組血清中TNF－α含量測定結(jié)果（ng/mL，s，n＝5）

表1 各組血清中TNF－α含量測定結(jié)果（ng/mL，s，n＝5）

＊：與J組比較，P＜0.01；＃：與N組比較，P＜0.05；＆：與F組比較，P＜0.01。－：表示無數(shù)據(jù)。

30min 2h 8h 24h 48h J組組別0.14±0.058 0.01±0.008 － － －N 組 17.14±2.329＊ 13.48±1.177＊ 32.98±3.155 23.03±1.254 14.14±4.460 F組 15.06±0.470＊＃ 10.55±0.890＊＃ 25.24±1.632＃ 21.87±1.717 12.6±1.036＃K 組 16.86±1.952＊ 11.65±0.986＊＃ 28.09±2.662＃＆ 22.82±1.359 14.78±4.600 ＆M 組 17.26±1.743＊ 11.99±1.291＊＃ 30.57±2.725＃＆22.49±1.490 13.92±2.498

表2 各組血清中IL－1β含量測定結(jié)果（ng/mL，s，n＝5）

表2 各組血清中IL－1β含量測定結(jié)果（ng/mL，s，n＝5）

＊：與J組比較，P＜0.01；＃：與N組比較，P＜0.05；＆：與F組比較，P＜0.01。－：表示無數(shù)據(jù)。

30min 2h 8h 24h 48h J組組別0.012±0.0019 0.007±0.0026 0.003±0.0014 － －N 組 0.131±0.0063＊ 0.111±0.0064＊ 0.085±0.0151＊ 0.204±0.0177 0.138±0.0201 F組 0.130±0.0058＊ 0.081±0.0054＊＃ 0.070±0.0091＊＃ 0.176±0.0151＃ 0.120±0.0070＃K組 0.132±0.0057＊ 0.093±0.0063＊＃ 0.082±0.0120＊＆ 0.180±0.0109＃ 0.128±0.0161 M 組 0.130±0.0058＊ 0.099±0.0123＊＃ 0.077±0.0060＊＆ 0.201±0.0138 ＆0.130±0.048

表3 致傷后各組肝臟GR蛋白表達結(jié)果（s，n＝5）

表3 致傷后各組肝臟GR蛋白表達結(jié)果（s，n＝5）

＊：與N組比較，P＜0.01；＃：與F組比較，P＜0.01；＆：與 M組比較，P＜0.01。

致傷后IOD與J組IOD的比值組別30min 2h 8h 24h 48h 72h N 組 0.737±0.098 0.414±0.217 0.452±0.214 0.468±0.263 0.566±0.046 0.509±0.103＆F組 0.842±0.096＊ 0.545±0.143＊ 0.681±0.118＊ 0.657±0.198＊ 0.673±0.242＊ 0.581±0.188＊＆K組 0.782±0.153＊ 0.503±0.158＊ 0.564±0.140＊＃ 0.594±0.243＊ 0.554±0.166 0.579±0.183＊＆M 組 0.764±0.164＃ 0.515±0.221＊ 0.583±0.207＊＃ 0.479±0.125＃ 0.512±0.212＃ 0.425±0.222＊

表4 N組和F組海馬NR1蛋白表達結(jié)果（s，n＝5）

表4 N組和F組海馬NR1蛋白表達結(jié)果（s，n＝5）

＊：與N組比較，P＜0.01。

致傷后IOD與J組IOD的比值組別0.135 1.055±0.204 1.137±0.154 F組 0.975±0.032 0.886±0.231＊ 0.882±0.129 1.015±0.141＊ 1.047±0.100 0.990±0.189 30min 2h 8h 24h 48h 72h N 組 0.964±0.104 0.807±0.127 0.858±0.171 0.922±＊

2.3致傷后各組肝臟GR蛋白表達 致傷后各組肝臟GR蛋白表達在致傷后30min開始均明顯降低（P＜0.01），2h達到最低（P＜0.01）；N組明顯低于其他各組（P＜0.01）；8h后F組明顯高于其他各組（P＜0.01）；M組在傷后72h明顯低于其他各組（P＜0.01）；但24h后各組間差異逐漸縮小。蛋白含量均以致傷后IOD與J組IOD的比值表示，見表3、圖1。

2.4N組和F組海馬NR1蛋白表達 海馬NR1蛋白表達在致傷后2h開始均明顯降低（P＜0.01），至24h基本恢復(fù)，72h明顯增加（P＜0.01）；2、24hF組明顯高于N組（P＜0.01）；但傷后72hF組明顯低于N組（P＜0.01）。蛋白含量均以IOD與J組IOD的比值表示，見表4、圖2。

圖1 致傷后各組肝臟GR蛋白在不同時間點變化的Western blot檢測結(jié)果

圖2 N組和F組NR1蛋白在不同時間點變化的Western blot檢測結(jié)果

3 討 論

應(yīng)激產(chǎn)生的一系列非特異性神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)目的是使機體抵抗力增強，保持和恢復(fù)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。病理應(yīng)激危害的主要原因之一是由高濃度糖皮質(zhì)激素（GC）造成的。應(yīng)激反應(yīng)程度一般與應(yīng)激原刺激強度呈正相關(guān)，刺激越強，反應(yīng)越強。當刺激原過度強烈，如嚴重創(chuàng)傷時，由于生物機體的高度復(fù)雜性，機體往往不能做出適度反應(yīng)，而出現(xiàn)應(yīng)激紊亂，甚至危及生命。GC效應(yīng)是機體最為重要的應(yīng)激反應(yīng)之一，其中GR是GC效應(yīng)發(fā)揮的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3］。本研究結(jié)果表明，嚴重TBI引起機體中樞和外周GR蛋白表達下調(diào)，從而有可能促進過度炎癥反應(yīng)形成和引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）、多器官功能障礙綜合征（MODS）等全身繼發(fā)性損害，甚至死亡。因此通過采取適當措施，調(diào)控創(chuàng)傷后GR的反應(yīng)具有重要意義。

目前關(guān)于麻醉藥物、麻醉方法對細胞因子的影響尚有爭議。以往認為，在單核細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中靜脈麻醉劑（相當于臨床劑量）誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生，氯胺酮以劑量依賴性方式抑制內(nèi)毒素刺激TNF－α的分泌，而在沒有內(nèi)毒素的情況下，氯胺酮并無作用。但近年研究揭示，氯胺酮具有直接抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的IL－6、8分泌的作用［4－5］。本實驗結(jié)果顯示，各致傷組 TNF－α和IL－1β含量傷后30min均明顯增高，24h后各組間差異逐漸縮小。F組明顯低于N組，而復(fù)合應(yīng)用兩種藥物比單獨應(yīng)用時降低更為明顯。這也證實了相關(guān)研究結(jié)果，氯胺酮等可以明顯抑制炎性因子的釋放。而IL－1β、TNF－α與腦創(chuàng)傷密切相關(guān)，因此氯胺酮－咪唑安定在TBI模型中能明顯降低這兩種細胞因子對腦保護和應(yīng)激調(diào)控就具有了更為重要的意義。并且復(fù)合應(yīng)用氯胺酮－咪唑安定后在傷后48h仍然與N組有明顯差異，這已經(jīng)超過了藥物的代謝周期，說明其機制可能存在中樞和外周等多種途徑，尚需進一步的研究說明。

本實驗結(jié)果顯示，小鼠嚴重TBI后存在GCR，肝臟GR蛋白表達明顯降低［6］，氯胺酮－咪唑安定雖然沒有改變肝臟GR蛋白表達變化趨勢，但明顯改善了GR蛋白表達的降低。各致傷組肝臟GR蛋白表達均明顯降低，N組明顯低于其他各組，F(xiàn)組明顯高于K、M組，各組間差異隨時間逐漸縮小。咪唑安定和氯胺酮復(fù)合應(yīng)用抑制TBI后GR蛋白表達下調(diào)的機制尚不清楚，可能是抑制了傷后下丘腦－垂體－腎上腺（HPA）軸過度興奮或（和）通過NR、GABA等抑制海馬GR蛋白表達下調(diào)，還可能與神經(jīng)中樞有效的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛，作用于交感－腎上腺髓質(zhì)和HPA軸，減輕創(chuàng)傷后組織損傷、疼痛、失血、缺氧、恐懼等引起的過度應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制炎性細胞因子的生成和釋放等有重要關(guān)系。有文獻報道，GC在海馬介導(dǎo)應(yīng)激性刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，在應(yīng)激后1h海馬GR mRNA明顯下降，這可能被NR、GABA等介導(dǎo)［7］。氯胺酮和咪唑安定作為通過NR和GABA作用藥物，在亞麻醉劑量出現(xiàn)明顯應(yīng)激調(diào)控作用，其作用機制之一是否是通過NR和GABA影響HPA軸興奮性，還有許多問題尚待闡明。而作者的前期研究也觀察到腹腔注射咪唑安定－氯胺酮后可明顯降低小鼠死亡率［2］，因此對嚴重創(chuàng)傷（如TBI、燒傷、戰(zhàn)傷等）后應(yīng)激反應(yīng)早期合理地使用咪唑安定－氯胺酮可能有助于減輕機體應(yīng)激反應(yīng)，利于創(chuàng)傷后恢復(fù)，提高生存率。

海馬結(jié)構(gòu)廣泛參與了學(xué)習(xí)、記憶等許多重要的生理過程，具有全腦缺血變化的全部特點。因此海馬是研究TBI等腦損傷與NR亞單位及其mRNA關(guān)系的理想對象。激活NR將導(dǎo)致HAP軸興奮性增加［7－8］；NR激動劑可以升高血皮質(zhì)醇水平，而NR拮抗劑AP－5可抑制谷氨酸引起的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子釋放，其原因可能是通過NR介導(dǎo)影響促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（ACTH）釋放，最終影響GC水平。此外NR還可能通過某種途徑影響海馬GR蛋白表達量，而影響HPA軸負反饋［7］；MR對于皮質(zhì)激素的親和力比GR高得多，靜息時其結(jié)合已基本飽和，參與基礎(chǔ)水平HPA軸的負反饋調(diào)節(jié)；應(yīng)激時高水平皮質(zhì)激素不僅與MR結(jié)合，也與GR結(jié)合通過一定途徑抑制HPA軸過度反應(yīng)。本實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠海馬NR1蛋白表達于致傷后2h開始明顯降低，至24h基本恢復(fù)，72h明顯增加。而F組2、24h明顯高于N組，但傷后72hF組明顯低于N組。這是一個有趣的現(xiàn)象，當NR1蛋白表達降低時，應(yīng)用咪唑安定－氯胺酮可以減輕這種變化；當NR1蛋白表達增高時，卻又可以抑制這種增高，即趨向于維持一種穩(wěn)態(tài)。而單獨應(yīng)用咪唑安定－氯胺酮卻無此現(xiàn)象，這似乎提示咪唑安定－氯胺酮在小鼠嚴重TBI中調(diào)控應(yīng)激、影響GR表達，其作用機制除了通過NR、GABA等環(huán)路作用影響HPA軸興奮性、通過外周直接作用影響細胞因子釋放外，是否還具有其他機制直接影響或維持海馬NR穩(wěn)態(tài)，從而控制HPA軸狀態(tài)，尚有待進一步探討。

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