遼寧省獸藥飼料監(jiān)察所 楊希國(guó) 李永才
香芹酚和百里香酚是 《飼料添加劑品種目錄(2008)》(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第1126號(hào))規(guī)定的允許在養(yǎng)殖動(dòng)物中使用的飼料香料劑。目前尚無(wú)檢測(cè)飼料香味劑中香芹酚和百里香酚的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及報(bào)道。本研究建立了飼料香味劑中香芹酚和百里香酚含量測(cè)定的高效液相色譜法,本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、選擇性好,為香味劑的檢測(cè)提供了技術(shù)支持。
1.1 儀器 Waters 2695型液相色譜儀 (配二極管陣列檢測(cè)器);超聲波清洗器;電子天平(精度0.0001 g和 0.00001 g)。
1.2 試劑和溶液 冰醋酸、甲醇為色譜純;95%乙醇為分析純;香芹酚(Sigma公司,純度98%);百里香酚(Sigma公司,純度99%);流動(dòng)相:甲醇+水+冰醋酸(60+40+2);標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取香芹酚500 mg,置50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,制成濃度為10 mg/mL的香芹酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液。精密稱取百里香酚500 mg,置50 mL容量瓶中,用95%乙醇溶解并稀釋至刻度,制成濃度為10 mg/mL的百里香酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液。臨用前,將香芹酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)貯備 液 用 甲 醇 稀 釋 成 濃 度 為 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、200.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL 的 標(biāo) 準(zhǔn) 工 作液。
1.3 色譜條件 色譜柱:Waters Symmetry C18色譜柱(粒度為 5 μm,柱長(zhǎng) 250 mm,內(nèi)徑 5 mm);流速為0.7 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為 274 nm;進(jìn)樣體積為 20 μL;柱溫為 30 ℃。
1.4 樣品測(cè)定
1.4.1 樣品提取 稱取飼料香味劑樣品2 g(精確至0.0001 g),置于250 mL容量瓶中,加甲醇超聲提取30 min,定容,過(guò)0.45 μm的濾膜,供液相色譜測(cè)定。
1.4.2 樣品測(cè)定 取20 μL處理好的樣品注入高效液相色譜儀中,以保留時(shí)間定性,以峰面積外標(biāo)法定量。
1.5 回收率及精密度測(cè)定 精密稱取飼料香味劑2 g,置于250 mL容量瓶中,添加香芹酚和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),按1.4方法測(cè)定,計(jì)算回收率和精密度。
1.6 定量限測(cè)定 添加不同水平香芹酚和百里香酚的飼料香味劑,按1.4方法檢測(cè),定量限以信噪比大于等于10(S/N≥ 10)計(jì)算。
2.1 波長(zhǎng)選擇 取0.1 mg/mL的香芹酚和百里香酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,結(jié)果在274.5 nm處有最大吸收波長(zhǎng)(見(jiàn)圖1)。用274 nm檢測(cè)時(shí)無(wú)雜質(zhì)峰干擾,香芹酚和百里香酚能完全分離。
圖1 香芹酚和百里香酚波長(zhǎng)掃描圖譜
2.2 色譜圖 標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖見(jiàn)圖2。圖2表明,香芹酚和百里香酚得到了很好的基線分離,峰形對(duì)稱,無(wú)雜質(zhì)峰干擾。
2.3 線性關(guān)系考察 配制濃度為 1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、200.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL 的香芹酚和百里香酚系列標(biāo)準(zhǔn)工作液后進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果香芹酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=23600X+7664.8,百里香酚標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=23787X+7740.1,相關(guān)系數(shù)均大于0.9999,結(jié)果表明,香芹酚和百里香酚在1.0~500.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.4 回收率和精密度測(cè)定結(jié)果 對(duì)某樣品進(jìn)行了11次測(cè)定,結(jié)果香芹酚和百里香酚的平均含量分別為23.5 mg/g和22.8 mg/g。對(duì)該樣品進(jìn)行了添加回收率實(shí)驗(yàn)。稱取2 g樣品,加入5 mg香芹酚和百里香酚,結(jié)果見(jiàn)表1。測(cè)得香芹酚的回收率為96.8% ~99.2%,平均回收率為98.2%,變異系數(shù)為1.0%;百里香酚的回收率為97.6%~101.4%,平均回收率為99.5%,變異系數(shù)為1.6%,該方法回收率高、重現(xiàn)性好。
2.5 定量限測(cè)定結(jié)果 添加不同水平香芹酚和百里香酚的飼料香味劑,按上述方法檢測(cè),當(dāng)添加水平為50 mg/kg時(shí),其信噪比均大于10(S/N>10),因此,確定方法的定量限為50 mg/kg。
表1 香芹酚和百里香酚的添加回收率和精密度
3.1 提取 香芹酚和百里香酚均能溶于醇、醚和堿溶液等,不溶或微溶于水。本研究分別考察了甲醇、無(wú)水乙醇和95%乙醇對(duì)飼料香味劑中香芹酚和百里香酚的超聲提取效果,結(jié)果表明無(wú)水乙醇和95%乙醇提取的回收率相仿,略低于甲醇提取的回收率。超聲時(shí)間30 min以上提取效果幾乎無(wú)變化。故選甲醇超聲提取30 min為樣品提取方法,此方法回收率高,樣品雜質(zhì)少,對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。
3.2 檢測(cè)條件 香芹酚和百里香酚屬同分異構(gòu)體,其沸點(diǎn)相差約5℃,氣相色譜分離較難;本研究采用高效液相色譜法Symmetry C18色譜柱分離,紫外檢測(cè)器檢測(cè),考察了甲醇+水+冰醋酸(60+40+2)和乙腈+水(65+35)作為流動(dòng)相的檢測(cè)效果,結(jié)果顯示乙腈和水作為流動(dòng)相色譜峰的對(duì)稱性差,而甲醇、水和冰醋酸混合作為流動(dòng)相香芹酚和百里香酚得到了很好的基線分離,峰形對(duì)稱,無(wú)雜質(zhì)干擾。
高效液相色譜法檢測(cè)飼料香味劑香芹酚和百里香酚,具有線性關(guān)系良好、回收率高、變異小的特點(diǎn),對(duì)飼料香味劑香芹酚和百里香酚定量分析準(zhǔn)確可靠,可以推薦用于飼料香味劑中香芹酚和百里香酚的檢測(cè)。