王麗敏,江清林,畢士有,史偉國(guó),趙錦程,張明遠(yuǎn)

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

貫葉金絲桃為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物,具有清熱解毒、抗抑郁、抗病毒等功效[1]。金絲桃苷(Hyperin,Hyp)屬黃酮醇苷化合物,是金絲桃屬植物的特征性成分之一。金絲桃苷毒性小,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、止咳、抗氧化、保護(hù)心血管系統(tǒng)等多種藥理學(xué)活性[2,3]。現(xiàn)在人們對(duì)金絲桃苷的毒理、藥理等基礎(chǔ)研究都做了大量的工作,并取得了豐碩的成果,但是金絲桃苷對(duì)體外腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用研究卻少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選用人肺腺癌細(xì)胞 A549、結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT8及前列腺癌細(xì)胞 PC3作為研究對(duì)象,對(duì)金絲桃苷體外抗腫瘤作用進(jìn)行初步探討,從而為開發(fā)出金絲桃苷的臨床新用途提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細(xì)胞、HCT8細(xì)胞及 PC3細(xì)胞均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。金絲桃苷購(gòu)自北京生物制品研究所,用二甲基亞砜溶解(終濃度≤0.01%),用含 2%小牛血清RPM I1640培養(yǎng)液稀釋至終濃度;四甲基偶氮唑藍(lán)(M TT)、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó) Sigma公司;小牛血清、青-鏈霉素雙抗、RPM I1640培養(yǎng)液購(gòu)自天津?yàn)笊锕?Fax-3200酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Awareness公司。

1.2 方法

1.2.1 A549細(xì)胞、HCT8細(xì)胞及 PC3細(xì)胞的培養(yǎng)

人腫瘤細(xì)胞 A549、HCT8、PC3均為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞,加入含 10%小牛血清,100U/mL青-鏈霉素的 RPMI1640培養(yǎng)液,置于 37℃恒溫、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰蛋白酶消化、傳代、繁殖細(xì)胞。

1.2.2 A549細(xì)胞、HCT8細(xì)胞及 PC3細(xì)胞形態(tài)的變化

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞用 0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞,用含 10%小牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液 ,以每孔 1× 105個(gè)細(xì)胞接種于 96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24h后,換液,加入不同濃度的金絲桃苷 (0.625 μg/mL,1.25 μg/mL,2.5μ g/mL,5μ g/mL,10 μg/mL,20μ g/mL)。 同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組為不加藥物只加等量二甲基亞砜;另設(shè)終濃度為 10 μg/mL的 5-FU陽(yáng)性對(duì)照組及不加細(xì)胞只加等量藥物的空白對(duì)照組。置 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng) 24h、48h、72h。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及存活狀態(tài)。

1.2.3 M TT法檢測(cè)金絲桃苷對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 A549細(xì)胞、HCT8細(xì)胞及 PC3細(xì)胞消化后,配成單細(xì)胞懸液,以每孔 1×105個(gè)細(xì)胞接種于 96孔培養(yǎng)板中,每孔體積 100μL,培養(yǎng) 24 h后,換液,加入不同濃度的金絲桃苷 (0.625μ g/mL,1.25 μg/mL,2.5 μg/mL,5 μg/mL,10 μg/mL,20μ g/mL),藥物的每一濃度設(shè) 4個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)終濃度為 10 μg/mL的 5-FU陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。加藥后再分別培養(yǎng) 24h、48h、72h,每孔加入 MTT溶液(5mg/mL)10 μL,37℃,繼續(xù)孵育 4h。終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入 100μLDM SO,振蕩 10min,使結(jié)晶物充分溶解。選擇 490nm波長(zhǎng),在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD值),計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照孔 OD值-實(shí)驗(yàn)孔 OD值 )/對(duì)照孔 OD值×100%。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間顯著性差異經(jīng) t檢驗(yàn)驗(yàn)證,以 P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)變化

在倒置顯微鏡下可見 A549細(xì)胞呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形,HCT8細(xì)胞呈多角形或梭形,PC3細(xì)胞呈不規(guī)則梭形。培養(yǎng) 24h、48h、72h后,對(duì)照組三種細(xì)胞均單層貼壁,細(xì)胞數(shù)量較多,形態(tài)正常,生長(zhǎng)狀態(tài)良好。金絲桃苷組、陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng) 24h后,細(xì)胞數(shù)量減少 ,細(xì)胞形態(tài)仍基本正常。金絲桃苷組、陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng) 48h后,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,金絲桃苷濃度高于 5 μg/mL以上時(shí),大量細(xì)胞變圓浮起,細(xì)胞形態(tài)較難辨認(rèn)。金絲桃苷組、陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng) 72h后,細(xì)胞稀少,金絲桃苷濃度高于 2.5 μg/mL時(shí),多數(shù)細(xì)胞變圓浮起,當(dāng)濃度達(dá)到 10 μg/mL時(shí)已難辨認(rèn)正常細(xì)胞的存在 ,絕大部分呈壞死碎片。

2.2 M TT比色實(shí)驗(yàn)

從表1、表2及表3結(jié)果可知,金絲桃苷體外可抑制人肺腺癌細(xì)胞 (A549)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT8)、人前列腺癌細(xì)胞(PC3)的增殖,在 0.625至 20 μg/mL的范圍內(nèi)具有明顯的劑量和時(shí)間依賴性。作用 24h、48h、72h時(shí)隨著劑量的增加,抑制作用更加明顯,而且隨著時(shí)間的增加,抑制作用變化明顯。表明金絲桃苷對(duì)三種腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性,其中A549細(xì)胞及 HCT8細(xì)胞對(duì)金絲桃苷的敏感性最高。支嚴(yán)重病變,綜合分析考慮該患者冠脈發(fā)生如此嚴(yán)重病變可

表1 金絲桃苷對(duì) A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

表1 金絲桃苷對(duì) A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

注:與5-FU對(duì)照組比較,*P＞ 0.05。

表2 金絲桃苷對(duì) HCT8細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

表2 金絲桃苷對(duì) HCT8細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

注:與 5-FU對(duì)照組比較,*P＞ 0.05。

表3 金絲桃苷對(duì) PC3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

表3 金絲桃苷對(duì) PC3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)的影響 ±s,n=6)

注:與5-FU對(duì)照組比較,*P ＜0.05。

3 討論

近年來,植物藥在惡性腫瘤治療中發(fā)揮著重要的作用,天然植物藥毒性低、療效好,日益受到重視,成為治療腫瘤的希望和新途徑,是當(dāng)前抗腫瘤新藥研究的主要發(fā)展方向。細(xì)胞通過分裂生成和本身相同的細(xì)胞群體也就是增殖來完成生長(zhǎng)過程。腫瘤借助腫瘤細(xì)胞的分裂增殖而不斷地生長(zhǎng)發(fā)展。癌細(xì)胞不斷增生是其侵襲發(fā)生的前提之一,抗腫瘤藥可通過抑制和殺滅細(xì)胞增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)來阻斷轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4]。因此我們選擇了三種人源癌細(xì)胞來研究金絲桃苷體外抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)方法采用 M TT法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,金絲桃苷在一定濃度范圍內(nèi)具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,可作為一種天然、低毒、有效的防癌抗癌物質(zhì)在腫瘤的治療和預(yù)防過程中發(fā)揮重要的作用。關(guān)于金絲桃苷抗腫瘤作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[1] Josey E S,Tackett R L.St John’s wort:a new alternative for depression[J].International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics,1999,37(3):111-113

[2] Song BW,M a CG,Xu SY.A new peripheral anlgesic agent:hyperin Asia pacific[J].J Pharmacoc,1988,3(2):1-2

[3] 李慶林,陳志武,馬傳庚.金絲桃苷對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞缺氧-再給氧損傷的影響[J].中草藥,2006,37(4):575-5771995,267(10):1445-1449