陳 哲,柳宏志,劉繼光

(1.佳木斯大學2007級碩士研究生,黑龍江佳木斯 154007;2.大慶油田總醫(yī)院,黑龍江 大慶 163001;3.佳木斯大學口腔醫(yī)院,黑龍江佳木斯 154002)

擴散和轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤患者生存時間和生存質(zhì)量的主要因素之一,口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率有增加趨勢,細胞骨架蛋白 Ezrin作為連接膜和細胞骨架的蛋白,位于調(diào)節(jié)細胞行為多種途徑的連接部位,影響細胞生存、運動、侵襲和黏附,與一些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移有關(guān)。 CD44v6蛋白是一種細胞黏附分子,具有黏附特性,能促進腫瘤細胞的浸潤、生長,在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用,本研究采用免疫組織化學染色技術(shù)檢測了口腔鱗癌中Ezrin蛋白和 CD44v 6的表達,旨在探討它們在口腔鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移中的作用及相互關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

口腔鱗狀細胞癌 32例。其中男19例,女 13例;年齡 40～81歲 ,平均 年齡 (60.5± 1.40)歲 ,其 中高分化 鱗癌 14例 ,中分化鱗癌 9例,低分化鱗癌 9例,TNM分期;T1+T2為 11例,T3+ T4為 21例。有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的17例 ,無頸淋巴轉(zhuǎn)移的 15例。其中 1人 14月后發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。對照組 28例正?？谇火つ碜粤夹阅[瘤患者邊緣手術(shù)標本。所有病例經(jīng) 2位以上病理科醫(yī)師確診,臨床資料來自住院及門診病歷。

1.2 試劑

鼠抗人 Ezrin蛋白免疫組化單克隆抗體、CD44V 6單克隆抗體、DAB顯色劑 ,S-P超敏試劑盒(鼠 /兔),購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 實驗方法

采用免疫組織化學抗生蛋白鏈菌素-生物素染色法。將4μ m厚的切片置于 55℃烘箱內(nèi)烘烤3h以上。常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度乙醇脫水。切片用體積分數(shù)3%雙氧水溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶,室溫8min。用0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH值 6.0)于微波爐內(nèi) 98℃抗原修復 8min,室溫冷卻。體積分數(shù)5%正常牛血清孵育15min(37℃),阻斷非特異背景反應。分別加入一、二、三抗體,抗體孵育均在濕盒微波爐內(nèi) 60～ 72℃孵育 5min,室溫 5min。每一步驟后經(jīng) 0.01mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗 3次,每次 5min。

一抗為 Ezrin單克隆抗體和 CD44v6單克隆抗體;二抗為生物素標記的羊抗鼠 /兔 IgG(linreagent);三抗為(鏈霉菌抗生物素蛋白—過氧化酶)streptavidin reagent。 DAB顯色,Mayer′s蘇木素復染,甘油明膠封片。每例取 1張切片 ,用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

Ezrin陽性著色在細胞膜及胞質(zhì)內(nèi),呈棕黃色顆粒 ,均一彌漫性分布。CD44v6陽性著色在細胞膜,呈棕黃色。兩者均按染色強度和陽性表達細胞數(shù) ,參考Mathew等[1]分級標準:(-)無表達;(+)50%細胞陽性表達或淺染;(?)≥50%陽性表達且深染。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,表達陽性率采用χ2檢驗,等級計數(shù)資料用秩和檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 口腔鱗狀細胞癌和正常口腔鱗狀上皮組織中 Ezrin和CD44-V6的表達

CD44v6蛋白定位細胞膜,為棕黃色顆粒,32例口腔鱗狀上皮癌中 25例陽性表達,陽性率為 78.12%;28例正?？谇簧掀ぶ?9例為陽性表達,陽性表達率為 32.14%,兩者表達差異顯著,有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05),Ezrin蛋白的陽性反應物質(zhì)主要見于細胞質(zhì),少數(shù)可見于細胞膜,32例口腔鱗狀上皮癌中21例陽性表達 ,陽性率為 65.62%;28例正常口腔上皮中 4例為陽性表達,陽性表達率為 14.28%,兩者表達差異顯著,有統(tǒng)計學意義 (P ＜ 0.05),見表1。

表1 CD44v6和 Ezrin在口腔鱗狀細胞癌和正常鱗狀上皮中表達的情況

2.2 口腔鱗狀細胞癌中 Ezrin蛋白、CD44V6的表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

口腔鱗癌組織中 Ezrin蛋白的表達與患者的年齡、性別,臨床分期無關(guān) (P＞ 0.05),與腫瘤的分化分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān) (P＜0.05)。CD44V6表達與患者的年齡、性別,臨床分期無關(guān) (P＞ 0.05),與腫瘤的分化分化程度(P ＜ 0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 (P ＜0.05)有關(guān)。 見表2。

表2 口腔鱗狀細胞癌中 Ezrin蛋白、CD44V6的表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 Ezrin和 CD44-v6在口腔鱗癌組織中表達的相關(guān)性

Ezrin和 CD44-v6二者之間的相關(guān)系數(shù)是 0.572,二者的表達呈正相關(guān) (P＜0.05),即 Ezrin表達越高,CD44-v6表達越高。見表3。

表3 CD44v6與Ezrin表達之間的關(guān)系

3 討論

Ezrin蛋白為膜細胞骨架蛋白,屬于 ERM家族成員之一,Ezrin蛋白主要定位于細胞膜內(nèi)側(cè) ,通過其 C端和 N端氨基酸殘基形成的結(jié)構(gòu)域分別同細胞骨架肌動蛋白和包膜發(fā)生作用,在細胞的生長、運動、遷移和信號轉(zhuǎn)移等一系列細胞功能方面發(fā)揮重要作用。研究表明,Ezrin蛋白通過調(diào)整粘附分子和信號轉(zhuǎn)導等途徑,參與細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的相互作用,從而在腫瘤發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。研究表明 ,在許多腫瘤組織中均可見Ezrin蛋白的高表達,如骨肉瘤、視網(wǎng)膜惡性黑色素瘤、胰腺癌等。該試驗結(jié)果表明 Ezrin蛋白在口腔鱗狀細胞癌中高表達,表達率高于正常口腔上皮組織,這與 Ezrin在其他組織中的結(jié)果類似,提示 Ezrin蛋白對口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用。在本實驗的病例中顯示 Ezrin的高表達和腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可見 Ezrin蛋白的表達可以用來預測腫瘤患者的預后,為早期判斷預后以及臨床治療提供有利的依據(jù)。

3.1 CD44v6的表達與口腔鱗癌的關(guān)系

CD44v6是CD44的變異體,作為主要的細胞表面的跨膜糖蛋白,是腫瘤細胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的決定因素之一。從本研究可以看出 CD44v6在口腔鱗狀細胞癌中的表達明顯高于口腔正常上皮組織,兩者差別有統(tǒng)計學意義,提示 CD44v6對口腔鱗癌發(fā)生具有重要的作用。 CD44v6與腫瘤的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān),從本實驗數(shù)據(jù)可以看出,分化程度越低的鱗癌組織中,CD44v6的表達水平越高,且具有統(tǒng)計學意義,在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鱗癌組織中,CD44v6的陽性率為 94.11%,在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鱗癌組織中其陽性率為60%,結(jié)果提示在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 (P＜0.05)。但有部分學者[2]認為CD44v6不能作為獨立口腔鱗癌的獨立的預測因子應用于臨床。

3.2 Ezrin蛋白和 CD44v6在口腔鱗癌中表達的相互關(guān)系

有學者研究表明,Ezrin蛋白可通過與 CD44v6的結(jié)合實現(xiàn)與細胞骨架的連接,而促進腫瘤的增生和轉(zhuǎn)移,同時CD44v6的高表達可以使功能性 Ezrin蛋白的表達增加 ,使得腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲能力也隨之增強[3]。在對神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、大腸癌等研究中發(fā)現(xiàn) Ezrin蛋白可直接或間接與 CD44v6蛋白等結(jié)合而調(diào)節(jié)瘤細胞的黏附性,影響腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移[4,5]。本研究結(jié)果顯示 ,在口腔鱗癌中的,Ezrin蛋白陽性表達率的增高,CD44v6陽性表達率也隨之增高,并且兩者有顯著的相關(guān)性 (P ＜0.05)。并且 Ezrin蛋白與 CD44v6同為陽性表達的鱗癌組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率要明顯高于 Ezrin蛋白與CD44v6同為陰性表達組,具有統(tǒng)計學意義 (P ＜0.05)。說明 Ezrin蛋白與 CD44v6具有且同作用,其高表達能夠促進口腔鱗癌組織的侵襲和轉(zhuǎn)移,對腫瘤預后的判斷具有重要的意義。

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