呂艷婷,王淑秋,宋立德

(1.浙江省諸暨市人民醫(yī)院病理科,浙江諸暨 311800;2.佳木斯大學(xué),黑龍江 佳木斯 154007)

癲癇(Epilepsy EP)是一組由大腦神經(jīng)元高度同步化異常放電所引起的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的慢性腦部疾病,具有突然發(fā)生、反復(fù)發(fā)作,可自然緩解的特點[1]。癲癇的病因 ,發(fā)病機(jī)制,演變過程十分復(fù)雜,迄今尚未完全明確。目前,針對癲癇發(fā)病機(jī)制的研究表明,作為神經(jīng)系統(tǒng)重要組成成分的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(AS)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中扮演重要角色,幾乎所有的癲癇病例手術(shù)切除標(biāo)本及動物實驗?zāi)Ｐ椭芯梢姷缴窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生。 AS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的大膠質(zhì)細(xì)胞,對神經(jīng)元的營養(yǎng),支持,修復(fù),再生起到重要作用,同時對有害刺激產(chǎn)生強(qiáng)烈反應(yīng),因此,AS的反復(fù)增殖活化與癲癇的發(fā)生演變的密切相關(guān)性越發(fā)受到重視。我國藥用植物資源豐富,靈芝孢子粉作為一種名貴中草藥,含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),如氨基酸及微量元素等,能有效調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力 ,清除氧自由基,增加耐低氧能力,降脂,保肝 ,抗衰老,抗腫瘤,并能穩(wěn)定膜離子通道,減輕鈣超載,而且對神經(jīng)系統(tǒng)還具有鎮(zhèn)靜和保護(hù)功能,降低受損傷神經(jīng)元的死亡率[2～6]。本實驗通過對 PCNA的檢測,探討靈芝孢子粉對戊四氮致癇大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活化的影響,進(jìn)一步研究癲癇發(fā)病機(jī)制及靈芝孢子粉作用機(jī)制,為尋找合理有效抗癲癇藥物提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性 Wistar大鼠 30只,體重(200±20)g,購自佳木斯大學(xué)實驗動物中心,隨機(jī)分為對照組、癲癇模型組和靈芝孢子粉干預(yù)組,每組各 10只。

1.2 模型制備

癲癇模型組和靈芝孢子粉干預(yù)組用亞驚厥劑量的 PTZ(35mg/kg體重)腹腔注射,注射時濃度為 10g/L,每日 1次,持續(xù) 28d,同時對照組以等容生理鹽水腹腔注射;靈芝孢子粉干預(yù)組經(jīng)灌胃給予靈芝孢子粉(150mg/kg體重),灌胃時濃度為30g/L;同時癲癇模型組和對照組以等容生理鹽水灌胃。

1.3 行為學(xué)觀察

每天對每只大鼠在 PTZ注射后進(jìn)行觀察并記錄癲癇發(fā)作的潛伏期 ,發(fā)作級別及持續(xù)時間,用藥 28d后停藥一周 ,再用相同劑量的 PTZ測試,凡出現(xiàn)連續(xù) 5次Ⅱ級以上癇性發(fā)作為達(dá)到點燃標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 免疫組織化學(xué)

實驗動物麻醉后斷頭處死,在低溫條件下迅速取腦,中性甲醛固定包埋,用切片機(jī)在視交叉后 2mm,按 5 μm每層進(jìn)行冠狀切片,制片后備用。 0.3%H2O2室溫孵育15min,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;抗原修復(fù);山羊血清封閉;依次加一抗 (兔抗大鼠 PCNA多克隆抗體 ,1:100,北京博奧森生物技術(shù)有限公司),37℃水浴箱孵育 90min;AP標(biāo)記的生物素化山羊抗兔 IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),37℃孵育 20min;試劑 SABC37℃孵育 20min。 DAB顯色 (2～ 5min,PCNA陽性反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色,位于胞核),脫水,透明,封片。光鏡下觀察。

1.5 Western-blot

動物分組與模型制備同步驟一、二,冰上迅速分離海馬,冰上勻漿 10min,加入裂解液裂解 30min,4℃下 12000rpm離心 15min,取上清備用。蛋白定量測定后 ,蛋白樣品采用 10%的 SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離,然后轉(zhuǎn)至 PV DF膜作免疫反應(yīng)。浸入封閉液 4℃過夜,然后依次加入適宜濃度的兔抗大鼠PCNA多克隆抗體,37℃孵育 2h,適宜濃度的生物素化的山羊抗兔 Ig G抗體 37℃孵育 1h,BCIP-NBT顯色(1:50,武漢博士德生物工程有限公司)。各反應(yīng)間用緩沖液充分洗滌。拍攝濾膜圖片留作永久性實驗記錄,用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目的條帶的分子量和凈光密度值。

1.6 圖像分析及統(tǒng)計學(xué)處理

每只實驗動物標(biāo)本隨機(jī)選擇 4個切面,每張切片隨機(jī)選擇5個400倍視野(共20個視野 /只 ),記錄每 400倍視野陽性細(xì)胞數(shù)用 BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析 PCNA免疫反應(yīng)性,Western-blot結(jié)果用 GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)分析 ,實驗中所得計量資料數(shù)據(jù)結(jié)果均以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示 ,多組之間的比較用方差分析,顯著性水準(zhǔn)為 0.05,使用 SPSS for Windows 11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察

對照組無癇樣發(fā)作,癲癇模型組有重度的癇樣發(fā)作(Ⅳ～Ⅴ級),靈芝孢子粉干預(yù)組有輕度的癇樣發(fā)作(Ⅰ～Ⅱ級),與癲癇模型組動物相比,靈芝孢子粉干預(yù)組大鼠潛伏期明顯延長,發(fā)作級別降低,少有大發(fā)作。

2.2 PCNA免疫組化結(jié)果

癲癇模型組大腦皮質(zhì)及海馬 PCNA免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)比空白對照組明顯增多,差異具有顯著性 (P＜0.01),靈芝孢子粉組大腦皮質(zhì)及海馬 PCNA免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)比癲癇模型組明顯減少 ,差異具有顯著性 (P ＜0.01)。(見表1與圖 1,圖 2)。

表1 大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)PCNA陽性細(xì)胞數(shù)的變化(± s,n= 10,個 /400倍視野 )

表1 大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)PCNA陽性細(xì)胞數(shù)的變化(± s,n= 10,個 /400倍視野 )

注:*與空白對照組比較,P＜0.01;#與癲癇模型組比較,P＜0.01。

組 別 皮 質(zhì) 海 馬空白對照組 10.20± 1.312.23± 0.48癲癇模型組 61.10±3.78* 35.30±2.21*靈芝孢子粉組 21.80±1.93# 8.60±1.07#

2.3 Western-blot檢測海馬區(qū) PCNA蛋白含量

PCNA分子量為 36KD,內(nèi)參為43KD?？瞻讓φ战M海馬區(qū) PCNA表達(dá)量很少,PT Z致癇后大鼠大腦海馬區(qū) PCNA表達(dá)量明顯增加,差異有顯著性(P ＜0.01),靈芝孢子粉干預(yù)組 PCNA表達(dá)量與癲癇模型組相比較明顯減少,差異有顯著性 (P ＜ 0.01)。(見表2,圖 3)。

表2 海馬區(qū) CyclinD1與 PCNA蛋白含量變化 ±s,n=10)

表2 海馬區(qū) CyclinD1與 PCNA蛋白含量變化 ±s,n=10)

注:與空白對照組比較,* P＜0.01;與癲癇模型組比較,#P＜0.01。

空白對照組 0.18±0.050.17±0.01癲癇模型組 0.56± 0.06* 0.59±0.01*靈芝孢子粉組 0.36±0.04# 0.38±0.02#

圖 3 大腦海馬區(qū) PCNA蛋白含量變化

3 討論

AS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的組成部分,其不僅發(fā)揮營養(yǎng)支持及協(xié)助代謝的功能同時參與 CNS的信息傳遞與整合。PCNA是一種核內(nèi)蛋白質(zhì),是 DN A聚合酶δ的輔助蛋白[7,8],可以與 CDK抑制劑 P21、CyclinD1和 CDK結(jié)合形成復(fù)合物 ,并能刺激 CyclinD1-CDK復(fù)合物對DN A連接酶的磷酸化,從而參與正常的 DN A復(fù)制、細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)變和受損 DNA的切除修復(fù)過程,與細(xì)胞的增殖周期密切相關(guān),其表達(dá)程度反映了細(xì)胞增殖活性的高低,是反映細(xì)胞增殖情況應(yīng)用最普遍的抗原標(biāo)記。本實驗免疫組化結(jié)果顯示,癲癇模型組與空白對照組相比較 PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多,表明細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)。而靈芝孢子粉治療組 PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于癲癇模型組。 Western-blot檢測結(jié)果與免疫組化相同,顯示靈芝孢子粉對PTZ致癇模型皮質(zhì)和海馬膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性有抑制作用。中醫(yī)藥治療癲癇歷史悠久,其中靈芝孢子粉具有調(diào)節(jié)免疫、提高機(jī)體耐缺氧能力,穩(wěn)定膜離子通道,減輕鈣超載,對神經(jīng)系統(tǒng)也有鎮(zhèn)靜和保護(hù)功能,從而激活機(jī)體內(nèi)在的抗損傷機(jī)制。綜上所述,靈芝孢子粉具有抑制PTZ致癇大鼠模型 PCNA表達(dá)和膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性、減輕癇樣發(fā)作的程度和抑制癇樣放電的作用,但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。靈芝孢子粉的這些作用可能在防治癲癇的發(fā)生發(fā)展和復(fù)發(fā)方面具有重要意義。

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