何經(jīng)緯，劉 晶，湯文杰

（1.四川省畜禽繁育改良總站，四川 成都 610041；2.四川省南充市高坪區(qū)馬家小學(xué)，四川 南充 637100；3.中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

本研究采集患病雛鵝樣本通過(guò)鵝胚分離病毒進(jìn)行病原學(xué)研究與血清學(xué)檢測(cè)，再以感染鵝胚尿囊液人工接種8日齡健康雛鵝，觀察在臨床上的主要病理變化特征?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)動(dòng)物：50只1日齡健康的四川白雛鵝，購(gòu)自雅安非小鵝瘟疫區(qū)，12～15孵化日齡非免疫鵝胚30枚；小鵝瘟病毒毒株:由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病防治研究中心分離自四川省樂(lè)山市10日齡患小鵝瘟死亡的四川白雛鵝；小鵝瘟標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清（本實(shí)驗(yàn)室保存）。1mL無(wú)菌注射器10支（12號(hào)針頭，5mm）、碘酒、酒精棉球、手術(shù)剪、紗布、研缽、冰箱、離心機(jī)、毛細(xì)管、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌器、孵化器、照卵器、記號(hào)筆、試管（10支）、青霉素空瓶（20個(gè)），青鏈霉素（各100萬(wàn)單位）、氯化鈉、瓊脂，飼料7.5kg，相關(guān)養(yǎng)鵝器具。

1.2 方法

1.2.1 病樣采集及處理 用無(wú)菌方法取患病雛鵝的肝臟、腦、腸等器官病料置滅菌的玻璃器皿中冷凍保存，作為病毒的分離材料。先將病料剪碎、磨細(xì)，用滅菌PBS液作1∶5倍稀釋?zhuān)磸?fù)凍融3次，經(jīng)3000 r/min離心30min，取上清液添加青鏈霉素（終濃度為10000單位/mL），經(jīng)細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)為陰性者置于4℃冰箱中保存為接種材料。

1.2.2 病毒返強(qiáng)試驗(yàn) 飼養(yǎng)1日齡雛鵝10只，肌肉注射尿囊毒液每只0.2～0.5mL。選擇10日內(nèi)有典型臨床癥狀的死亡雛鵝，取其肝、腦于研缽內(nèi)，剪碎、研磨，用生理鹽水（含雙抗1萬(wàn)單位/mL）制成5倍乳劑，經(jīng)5 000 r/min離心10min，反復(fù)凍融數(shù)次，取上清置于4℃冰箱中過(guò)夜（反復(fù)幾次，直到死亡率達(dá)60%～80%）。

1.2.3 鵝胚接種 用上述接種材料接種12～15孵化日齡非免疫鵝胚30枚。參看文獻(xiàn)進(jìn)行尿囊腔接種，每枚胚尿囊腔注射0.2～0.5mL。38℃繼續(xù)孵化5～8d，24h內(nèi)死亡者棄去。每隔8h照蛋觀察一次，收集24～120h死亡的胚置于4℃冰箱內(nèi)，冷卻收縮血管，12h后無(wú)菌收集尿囊液，添加青鏈霉素（終濃度10000單位/mL），靜置作用2h，凍存。注意觀察鵝胚頭、四肢病理解剖變化。

1.2.4 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 被檢測(cè)抗原制備：取患病雛鵝的肝臟、腦、腸等器官病料置滅菌的玻璃器皿中剪碎、磨細(xì)，用無(wú)菌生理鹽水作1∶2～1∶3倍稀釋?zhuān)?℃冰箱中凍融2次。經(jīng)3000 r/min離心30min，取上清液加入等量的氯仿，振搖30min。經(jīng)3 000 r/min離心30min，取上清液凍融1次，再經(jīng)3 000 r/min離心30min，取上清液加入等量的氯仿，振搖30min。又經(jīng)3 000 r/min離心30min，舍去上清液，收集病毒沉淀物。取0.01M的PBS（pH 7.2）適量懸浮病毒沉淀，加入0.1%的甲醛滅活后，即為小鵝瘟病毒沉淀抗原。

瓊脂平板制備：在1 000mL生理鹽水中加入優(yōu)質(zhì)瓊脂1g，加熱使其完全溶解后，調(diào)整pH值至7.8澆鑄成3mm厚的平板，待冷卻后打孔。中央1孔，周?chē)?孔，孔徑3mm，孔距4mm，并用熔化瓊脂封底。

檢測(cè)方法：用已知診斷抗血清來(lái)檢測(cè)制備的抗原，中央孔加入診斷抗血清，周?chē)准尤?1∶4、1∶6、1∶8 倍稀釋的被檢測(cè)抗原，并設(shè)置一組重復(fù)。將加樣后的瓊脂平板置于濕盒中，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔12 h觀察1次，至48 h結(jié)束，記錄結(jié)果。

1.2.5 雛鵝人工感染試驗(yàn) 攻毒前，先將50只1日齡四川白雛鵝（其中20只為試驗(yàn)組，10只為同居組，20只為對(duì)照組）。飼養(yǎng)在未被小鵝瘟病毒污染的環(huán)境中，觀察7d以確保其為健康雛鵝。7d后試驗(yàn)組進(jìn)行滴鼻接種感染鵝胚尿囊液（1mL/只），同居組、對(duì)照組不作任何處理。在此后的 10min、30min、60min、90min、4h、12h、48h、72h、9d、15d 解剖試驗(yàn)組、同居組、對(duì)照組小鵝各2只，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、胸腺、哈德氏腺、法氏囊、食管、氣管、腸等部位觀察剖檢變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝胚接種結(jié)果 將采集后處理過(guò)的病料接種于30只鵝胚，24h內(nèi)未見(jiàn)死亡的鵝胚，鵝胚在2～7 d死亡的有25只，計(jì)算該病毒對(duì)鵝胚的致死率為84%。無(wú)菌條件下收集尿囊液，每枚約收集尿囊液4～6mL。觀察鵝胚病變：尿囊液透明清亮；絨毛尿囊膜有出血點(diǎn)；胚體充血、出血。

2.2 病毒返強(qiáng)試驗(yàn)結(jié)果 第1次病毒返強(qiáng)時(shí)，10日內(nèi)10只雛鵝死亡8只，死亡率為80%，已達(dá)到病毒返強(qiáng)目的，故共只有1次病毒返強(qiáng)試驗(yàn)。雛鵝死亡時(shí)間分布見(jiàn)表1。

表1 小鵝瘟病毒返強(qiáng)時(shí)雛鵝死亡時(shí)間分布

2.3 瓊擴(kuò)結(jié)果 在中央孔加入診斷抗血清，周?chē)?、2、3 孔內(nèi)分別加入 1∶4、1∶6、1∶8 倍稀釋的被檢測(cè)抗原，1′、2′、3′為一組重復(fù)。該抗原在瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中能夠與小鵝瘟陽(yáng)性血清出現(xiàn)沉淀線，屬于陽(yáng)性反應(yīng)，且與小鵝瘟標(biāo)準(zhǔn)抗原形成的沉淀線相吻合。見(jiàn)圖1。

圖1

2.4 滴鼻攻毒組臨床癥狀 從第8 d開(kāi)始有攻毒鵝因小鵝瘟病毒致死，從第10 d開(kāi)始有同居鵝因小鵝瘟致死。死前癥狀：兩腿呈劃水狀，喙端、爪尖發(fā)紺。繼續(xù)觀察各組的臨床表現(xiàn)，攻毒組、同居組都表現(xiàn)為精神萎頓，食欲減退，不愿活動(dòng)，出現(xiàn)嚴(yán)重下痢，排灰白色或青綠色稀糞，糞中帶有纖維碎片或未消化的飼料等，臨死前頭觸地，兩腿抽搐。對(duì)照組的雛鵝生長(zhǎng)情況良好。

2.5 雛鵝人工感染試驗(yàn)剖檢結(jié)果 滴鼻組解剖變化：肝臟有出血點(diǎn)或淤血，膽囊充盈，心臟部分部位有點(diǎn)狀出血，十二指腸彌漫性出血，腸壁變薄，盲腸有香腸樣栓塞，泄殖腔潴留少量黃白色液體，腦膜充血、出血。這與相關(guān)資料報(bào)道的相一致。同居組解剖變化：肝臟有出血點(diǎn)，膽囊充盈，脾臟腫大，心臟部分部位有點(diǎn)狀出血，十二指腸彌漫性出血，盲腸有香腸樣栓塞，泄殖腔有出血且潴留少量黃白色液體，腦膜充血。

同居組死鵝幾乎與攻毒組死鵝有同樣的臨床表現(xiàn)和解剖變化，差別只是攻毒組的發(fā)病時(shí)間比同居組的早。

3 討論

3.1 小鵝瘟病毒感染小鵝后主要表現(xiàn)為體液免疫反應(yīng)，首先出現(xiàn)IgM，然后是IgG，康復(fù)的雛鵝以及經(jīng)過(guò)隱性感染的成年鵝均能產(chǎn)生高水平的病毒中和抗體和沉淀抗體，并持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間，還能將抗體通過(guò)卵黃傳給后代，使孵出的雛鵝免于發(fā)病。以小鵝瘟病毒抗原反復(fù)免疫兔、牛、羊、豬等動(dòng)物，也能產(chǎn)生高水平的病毒中和抗體和沉淀抗體，并可用于小鵝瘟病毒感染的預(yù)防和治療。將小鵝瘟病毒通過(guò)非免疫鵝胚傳代增殖，取感染胚尿囊液制備小鵝瘟病毒沉淀抗原，該抗原在瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)中能夠與小鵝瘟陽(yáng)性血清出現(xiàn)沉淀線。本試驗(yàn)結(jié)果表明，本次制備的小鵝瘟病毒沉淀抗原可以用于小鵝瘟臨床免疫效果監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)其研究、診斷和防治具有實(shí)用價(jià)值。

3.2 關(guān)于小鵝瘟病毒沉淀抗原的制備，國(guó)內(nèi)資料報(bào)道了4種方法：王永坤等將感染的尿囊液裝入透析袋硅膠濃縮；郝虹等采用0.40 kg/L飽和度的硫酸銨鹽析處理；王新海通過(guò)差速離心法提取抗原；程由銓等使用聚乙二醇（PEG）沉淀病毒。按照病毒學(xué)理論，病毒一般在0.45 kg/L以上飽和度的硫酸銨鹽析中發(fā)生沉淀，0.40 kg/L的飽和度不可取。差速離心法需要使用40000 r/min的轉(zhuǎn)速，這不是普通實(shí)驗(yàn)室的離心設(shè)備所能達(dá)到的，而且在實(shí)際應(yīng)用中也不易操作。本次試驗(yàn)采用反復(fù)離心加氯仿抽提的方法成功地制備了小鵝瘟病毒沉淀抗原，是一種快速、有效的制備方法，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

3.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)是根據(jù)可溶性抗原與可溶性抗體在含有電解質(zhì)的瓊脂網(wǎng)狀基質(zhì)中向四周自由擴(kuò)散，由近向遠(yuǎn)形成濃度梯度的原理而進(jìn)行的。當(dāng)抗原與抗體在瓊脂基質(zhì)中適合比例下相遇，便可相互結(jié)合，產(chǎn)生抗原抗體復(fù)合物，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀線。影響瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的因素有：（1）反應(yīng)物的濃度。兩反應(yīng)物濃度越高，所形成的沉淀線越清晰。（2）反應(yīng)的溫度。在一定的范圍內(nèi)（如0～37℃）溫度越高，物質(zhì)擴(kuò)散速度越快，沉淀線形成越快。為減少沉淀線的變化，并保持清晰度，可在37℃形成沉淀線后置溫室或冰箱中。（3）反應(yīng)時(shí)間。沉淀線一般1～3d出現(xiàn)，14～21d數(shù)目最多，只有在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)，才可以見(jiàn)到清晰的線條，時(shí)間太長(zhǎng)則可能出現(xiàn)沉淀線的分裂、溶解、擴(kuò)散甚至消失。此外沉淀線的形成還與反應(yīng)物的性質(zhì)、瓊脂的濃度、抗原抗體孔間距離等有關(guān)。

[1]甘孟侯.中國(guó)禽病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000：12-13.

[2]傅繼華.病毒學(xué)實(shí)用實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，2001：47-49.

[3]佘永建，胡世君，黃 偉，等.利用瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)小鵝瘟病毒抗原及抗體的研究[J].中國(guó)畜禽傳染病，1995：202-204.

[4]陳曉月，趙承輝，劉麗霞，等.鵝細(xì)小病毒野株分離鑒定及致病力試驗(yàn)[J].畜牧與獸醫(yī)，2006，38（6）：41-42.

[5]姜 平.獸醫(yī)生物制品學(xué)（第2版）[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003：337-338.

[6]王永坤.番鴨細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的克隆與鑒定[J].中國(guó)微生物學(xué)報(bào)，1996，（8）：78-82.

[7]郝 虹.小鵝瘟病毒核酸鏈型與結(jié)構(gòu)蛋白分析[J].病毒學(xué)報(bào)，1988，4（1）：28-32.

[8]王新海.小鵝瘟瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的研究[J].家禽傳染病，1989，（5）：11-13.

[9]程由銓?zhuān)媪?番鴨細(xì)小病毒和鵝細(xì)小病毒生化及基因組特性的比較[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，9（5）：429-433.