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        西南地區(qū)鴨疫里默氏菌血清型調(diào)查和三價(jià)滅活油乳劑疫苗的研制

        2010-06-19 05:25:34,岳,2,湯,2
        四川畜牧獸醫(yī) 2010年3期
        關(guān)鍵詞:鴨疫三價(jià)雛鴨

        田 令 ,岳 華 ,2,湯 承 ,2

        (1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041;2.四川省高等院校動(dòng)物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041)

        1 材料

        1.1 菌株 2006年1月至2009年7月,從四川、重慶、云南規(guī)?;B(yǎng)鴨場中分離得到的261株鴨疫里默氏菌(RA),均為本室保存。

        1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡健康櫻桃谷鴨,購自成都某種禽公司;昆明系雄性小白鼠18~22g,購自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

        1.3 培養(yǎng)基和血清 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)購自杭州微生物試劑有限公司;LB培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室配制;新生小牛血清購自成都哈里生物公司;血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型RA參考菌株由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心李明義教授惠贈。10號白油購自廣州俏靈兒生物科技有限公司。

        2 方法

        2.1 血清型鑒定 采用玻片凝集試驗(yàn)對261株RA分離菌株進(jìn)行血清型鑒定。

        2.2 RA菌液濃度的測定 將RA接種于含5%小牛血清的LB肉湯中,置于37℃下振蕩培養(yǎng)18h,用菌落平板計(jì)數(shù)法測定10倍系列稀釋菌液的CFU,同時(shí)用紫外分光計(jì)測定對應(yīng)濃度菌液的OD值,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        2.3 疫苗株的篩選 挑選血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA分離菌株各5株,分別制備不同血清型的RA單價(jià)滅活油乳劑疫苗,疫苗中的抗原濃度為1.0×109CFU/mL。按下列程序免疫小鼠,每種疫苗免疫5只小鼠:首免,頸部和背部四點(diǎn)注射,每只0.2mL;分別間隔15d和10d后用相同劑量和方法進(jìn)行二免和三免;三免后第9 d對各組小鼠斷尾采血,分離血清,用玻片凝集試驗(yàn)檢測血清RA凝集價(jià),選擇各血清型中凝集價(jià)最高的RA菌株為疫苗種子株。

        2.4 RA三價(jià)滅活油乳劑疫苗的制備 分別將3個(gè)血清型RA種子株接種于含5%血清的LB肉湯中,37℃振蕩培養(yǎng)18h,加入0.3%甲醛溶液后置于37℃振蕩培養(yǎng)箱里滅活18h,按文獻(xiàn)方法制備RA三價(jià)滅活油乳劑疫苗,疫苗中各型抗原含量均為1.6×109CFU/mL,同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)。

        2.5 安全性試驗(yàn) 將33只3日齡健康雛鴨隨機(jī)平均分成3組,每組11只。第1組注射RA三價(jià)滅活油乳劑疫苗1mL,第2組注射三價(jià)滅活油乳劑疫苗2mL,第3組注射1mL無抗原佐劑乳化物作為免疫空白對照。

        2.6 免疫效力測定 將288只3日齡健康雛鴨平均分成2組,每組 144只。第1組為免疫組,經(jīng)頸部皮下接種0.5mL/只RA三價(jià)滅活油乳劑疫苗;第2組為空白對照組,經(jīng)頸部皮下接種相同劑量的無抗原佐劑乳化物。各組于免疫后第6 d、14 d、21 d、28 d分別用Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA攻毒。每組每個(gè)血清型分別攻毒12只,2×108CFU/只,連續(xù)觀察7d,記錄發(fā)病死亡情況。對死亡鴨進(jìn)行剖檢和細(xì)菌分離,存活鴨于觀察結(jié)束時(shí)處死,同樣進(jìn)行病例剖檢和細(xì)菌分離,以未出現(xiàn)病變和RA分離陰性為免疫保護(hù)。

        3 結(jié)果

        3.1 RA分離株的血清型 對261株RA血清型的鑒定結(jié)果顯示,血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ型RA分別占總分離株的39.85%、17.24%、11.11%、8.8%,未檢出血清Ⅲ型菌株,未定型菌株占23.2%。

        3.2 疫苗種子株的篩選結(jié)果 根據(jù)免疫后小鼠血清平板凝集價(jià)分別篩選出血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ 型RA疫苗的種子株各1株,菌株編號為SWUN0269、SWUN1065、SWUN1093。

        3.3 疫苗質(zhì)檢結(jié)果 RA三價(jià)滅活油乳劑疫苗離心15min無分層現(xiàn)象,滴于冷水表面不分散,為油包水狀態(tài),黏度試驗(yàn)顯示流速為6.4s,菌檢結(jié)果為陰性。

        3.4 疫苗的安全性 2mL/只注射組的雛鴨僅在12h內(nèi)精神稍差,食欲有所下降,之后恢復(fù)正常;1mL/只注射組和1mL/只空白對照組的鴨只未見異常。

        3.5 疫苗免疫效力 三價(jià)滅活油乳劑疫苗首免后各組鴨只的攻毒保護(hù)情況見表1。

        表1 RA三價(jià)滅活油乳劑疫苗免疫后不同時(shí)間的攻毒保護(hù)結(jié)果

        從表1可見,免疫后6 d攻毒,免疫組和空白對照組之間保護(hù)數(shù)無顯著差異,說明此時(shí)疫苗尚未產(chǎn)生有效免疫保護(hù);至免疫后第14 d,免疫組的攻毒保護(hù)率顯著高于空白對照組,對3個(gè)血清型的攻毒保護(hù)率均在83.33%~100%,并持續(xù)至28 d未見下降。

        4 討論

        本研究結(jié)果顯示西南地區(qū)至少存在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ4個(gè)不同的血清型,說明西南地區(qū)鴨群中鴨疫里默氏菌病的病原復(fù)雜多樣,血清Ⅰ、Ⅱ型為優(yōu)勢血清型,與國內(nèi)其他地區(qū)情況類似。值得注意的是,2003年四川、重慶、云南等省市的血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型RA菌株占總分離株的52.06%,而我們的研究結(jié)果顯示2006~2009年這些地區(qū)Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型分離株占總分離株的68.20%,分離率有顯著增高的趨勢,這也是本研究選擇研究三價(jià)滅活疫苗的重要依據(jù)。

        此次我們的研究結(jié)果顯示,在3日齡免疫后14d分別用同型RA攻毒,其保護(hù)力均達(dá)到83.33%以上,有的血清型的保護(hù)率高達(dá)91.67%,與文獻(xiàn)比較有的血清型攻毒保護(hù)力稍低,這可能與攻毒濃度及不同血清型RA毒力差異和對雛鴨免疫的日齡有關(guān)。從后兩次攻毒保護(hù)試驗(yàn)來看,最高保護(hù)力也可達(dá)到100%,且持續(xù)至28d保護(hù)力未下降,說明該三價(jià)滅活油乳劑疫苗在對雛鴨進(jìn)行一次免疫后就具有很好的保護(hù)力,且持續(xù)期長,足以保護(hù)雛鴨至上市日齡。

        [1]卡爾尼克·B·W.高 福,劉文軍譯.禽病學(xué)(10版)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999:195-202.

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        [3]胡清海.鴨疫里氏桿菌病三價(jià)油乳劑滅活疫苗的研究[J].中國獸醫(yī)科技,2002,(7).

        [4]李文楊.福建省鴨疫里默氏菌血清流行病學(xué)調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2002,(2).

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        [6]韋 強(qiáng).浙江省鴨疫里氏桿菌的優(yōu)勢血清型[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2003,(4).

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