楊國(guó)鋒 ，孫 娟 ，張家驊

（1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 400716；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，山東 青島 266109）

AFLP是1993年由荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos建立的一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法，結(jié)合了RFLP和RAPD的優(yōu)點(diǎn)，既具有RFLP標(biāo)記的專一性、可靠性，又具有RAPD標(biāo)記的隨機(jī)性、方便性。該技術(shù)自1995年報(bào)道以來，以較好的穩(wěn)定性和較高的多態(tài)檢出率而受到分子生物學(xué)家的關(guān)注，并得到了廣泛應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集 血樣采自重慶市大足縣某羊場(chǎng)。

1.2 試劑 TaqDNA聚合酶、dNTPs、T4DNA連接酶、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED、過硫酸銨、尿素、親和硅烷、剝離硅烷、引物為北京鼎國(guó)產(chǎn)品；TaqⅠ、EcoRⅠ酶為Promega公司產(chǎn)品。接頭、引物序列見表1。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 采用常規(guī)的苯酚-氯仿法。

1.3.2 接頭的準(zhǔn)備 EcoRⅠ和TaqⅠ接頭濃度分別為5pM和50pM。

1.3.3 基因組DNA的酶切和接頭的連接 酶切：DNA 0.5μg、EcoRⅠ5 U、TaqⅠ5 U、5×R/L buffer 3μL，加ddH2O 至 15μL；離心，37℃孵化 2～3 h，70℃孵化15min，使內(nèi)切酶失活。連接：加入混合液（EcoRⅠ接頭 1 μL、TaqⅠ接頭 1μL、5×R/L buffer 2μL、T4 DNA ligase 2 U、ATP 1mM，加 ddH2O 至 10μL），37℃孵化8 h或過夜。0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，用TE0.1溶液將產(chǎn)物按1∶10比例稀釋，-20℃保存。

表1 AFLP接頭、預(yù)擴(kuò)增、擴(kuò)增引物序列

1.3.4 限制性片段預(yù)擴(kuò)增 引物為50ng/μL，預(yù)擴(kuò)增體系：EcoRⅠ+A、TaqⅠ+A/C 各 1.5μL、dNTPs 0.2mM、Taq 酶 1.5U、10×PCR buffer（含 Mg2+）5 μL、稀釋產(chǎn)物5μL，用ddH2O補(bǔ)足50μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃ 2min；94℃ 60 s，56℃ 60 s，72℃ 60 s，共 26 個(gè)循環(huán)；72℃5min，4℃保存。0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，用TE0.1將產(chǎn)物按1∶10比例稀釋，-20℃保存。

1.3.5 限制性片段選擇性擴(kuò)增 擴(kuò)增體系：EcoRⅠ、TaqⅠ引物各1.5μL，其余同上（限制性片段預(yù)擴(kuò)增），PCR 擴(kuò)增條件：94℃ 2min；94℃ 30s，65℃ 30 s，72℃60 s（以后每個(gè)循環(huán)的退火溫度降0.7℃），共13個(gè)循環(huán)，接著94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，共23個(gè)循環(huán)；72℃ 2min，4℃保存。擴(kuò)增后，取5μL選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物，加5μL上樣緩沖液，95℃變性3min，冰浴冷卻，備用。

1.3.6 電泳 瓊脂糖凝膠電泳后，采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染，掃描成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果 DNA條帶致密整齊，無拖尾，所得基因組無降解；總DNA分子量大小在50kb以上；所測(cè)樣品OD260/OD280在1.8左右，說明蛋白質(zhì)和DNA提取過程中的其他殘留較少。酶切基因組DNA的主帶消失，呈梯度模糊狀，說明酶切充分，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物，無拖帶，擴(kuò)增產(chǎn)物效果良好。

2.2 變性聚丙烯酰胺檢測(cè)結(jié)果 從15對(duì)引物中篩選，有11對(duì)引物擴(kuò)增效果較好，擴(kuò)增出了766個(gè)條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出69.6個(gè)條帶，其中發(fā)現(xiàn)59條多態(tài)條帶，平均多態(tài)率為5.36%，結(jié)果見表2。

3 分析討論

3.1 關(guān)于實(shí)驗(yàn)條件

表2 11對(duì)引物組合的遺傳多樣性

3.1.1 高質(zhì)量DNA樣品的準(zhǔn)備 高質(zhì)量DNA樣品至少具備以下特性：分子量高，在DNA的提取過程中，為防止DNA斷裂，振蕩一定要柔和；純度高，不能含抑制限制性內(nèi)切酶活性的物質(zhì)，否則將使隨后的DNA酶切不完全，應(yīng)注意避免核酸酶、其他DNA污染和抑制物質(zhì)的存在。

3.1.2 限制性核酸內(nèi)切酶的選擇 常采用兩種限制性內(nèi)切酶，一種酶的識(shí)別位點(diǎn)為4個(gè)堿基，可以產(chǎn)生小片段DNA便于擴(kuò)增，另一種為6個(gè)堿基，可控制擴(kuò)增片段的數(shù)量。EcoRⅠ可靠、高效而價(jià)廉，是六堿基內(nèi)切酶的首選酶類；而四堿基內(nèi)切酶在分析植物和微生物基因組時(shí)大多選用MseⅠ，分析動(dòng)物基因組時(shí)常用TaqⅠ。Msp和Hinp識(shí)別序列（CCGC，GCGC）含有GC雙堿基序列，因此也可以替代TaqⅠ使用。

3.1.3 關(guān)于銀染 銀染過程中，水質(zhì)很重要，應(yīng)保證水的純凈和容器的潔凈。季節(jié)對(duì)銀染效果也有影響，銀染效果以夏秋季節(jié)較好，冬季染色效果不良。加甲醛使Ag2+還原成銀顆粒，應(yīng)待硝酸銀充分溶解并搖勻后，再將玻璃板放入，否則會(huì)造成背景雜亂。顯影時(shí)間過短，則顯影不充分，譜帶模糊；過長(zhǎng)，膠板上部大分子量片段被背景遮蓋，影響結(jié)果統(tǒng)計(jì)，要在主要帶紋出現(xiàn)后立即定影，一般5～8min左右即可充分顯影。顯影液溫度可適當(dāng)?shù)鸵恍?，這樣可降低背景顏色，但不可過低，否則會(huì)使顯色時(shí)間延長(zhǎng)，影響實(shí)驗(yàn)效果。

3.2 關(guān)于多態(tài)性 平均多態(tài)率僅5.36%，較低，原因有：個(gè)體間親緣關(guān)系近，堿基差異小；擴(kuò)增條帶多集中于凝膠上部，其分子量較大，堿基的差異不易檢測(cè)。顯色往往是自上而下，上下顯影相差1～2min，時(shí)間不同步就會(huì)造成小片段不能完全顯色。因此，多態(tài)條帶集中在一定區(qū)域，本實(shí)驗(yàn)差異片段主要集中在150bp～600bp之間。

[1]Pieter V，Rene H，et al.AFLP：a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Res.，1995，21：4407-4414.

[2]朱文進(jìn)，曹瑞琴，張紀(jì)剛，等.分子標(biāo)記AFLP及其在遺傳分析中的應(yīng)用 [J].動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2001，19（5）：21-23.