司曉云,程友琴,李小鷹,韓麗娜,譚國(guó)娟,吳倫寬

高血壓是引起心力衰竭的常見(jiàn)病因之一。近年研究揭示在心力衰竭的形成過(guò)程中,體內(nèi)氧化/抗氧化失衡是一重要機(jī)制。體內(nèi)血紅素氧合酶-1/一氧化碳-膽紅素(HO-1/CO-膽紅素)系統(tǒng)是近年新發(fā)現(xiàn)的重要的內(nèi)源性抗氧化體系[1,2]。筆者假設(shè)外源性給予HO-1的作用底物氯化血紅素(hemin,Hm),通過(guò)誘導(dǎo)體內(nèi)HO-1/CO-膽紅素系統(tǒng),有可能改變體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài),減緩心力衰竭的發(fā)展進(jìn)程,為臨床心力衰竭的預(yù)防和治療提供新的治療靶點(diǎn)和手段。

1 材料與方法

1.1 藥品試劑及主要儀器 Hm購(gòu)于和田龍生物科技有限公司、大鼠HO-1試劑盒(武漢中美)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒購(gòu)于南京建成生物有限公司,氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)試劑盒購(gòu)于尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)(北京)有限公司。主要儀器有 RM6240C多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)、尾動(dòng)脈壓測(cè)量?jī)x(成都儀器廠)、ALOKA SSD-5500SV彩色超聲診斷儀(日本Aloka公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及心衰模型建立 健康雄性5周齡SD大鼠63只,體重(250±30)g〔北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,合格證號(hào):SCXK(京)2007-0001〕隨機(jī)分為對(duì)照組、心衰組、氯化血紅素組,每組各21只,心衰組和血紅素組參照文獻(xiàn)方法加以改進(jìn)制備壓力負(fù)荷性心衰模型[3]。3周后氯化血紅素組開始以Hm 60 mg/(kg·d)灌胃,連續(xù)給藥 12周;對(duì)照組、心衰組分別同時(shí)予以同等體積生理鹽水灌胃。各組分別在給藥后4、8、12周時(shí)取7只進(jìn)行血液及血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)并處死。

1.3 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉,仰臥固定于固定架上,左胸前部剃毛,使大鼠成左傾30度體位,采用日本ALOKA SSD-5500SV型超聲診斷儀,S12探頭,頻率7.5MHz,由二維超聲圖像引導(dǎo)M形曲線進(jìn)行測(cè)量,心動(dòng)周期重復(fù)3次,取平均值,記錄或計(jì)算舒張末室間隔(interventricular septum,IVS)厚度、舒張末左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension,LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension,LVESD)、左室質(zhì)量〔LVM=1.04×(LVED+LVPWT+IVS)3-LVEDD3〕、左室射血分?jǐn)?shù)〔LVEF(%)=(LVEDD3-LVESD3)/LVEDD3×100%〕、左室短軸縮短率〔LVFS(%)=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100%〕。

1.4 血標(biāo)本采集 經(jīng)頸動(dòng)脈插管取血9ml,迅速注入放在冰水浴中冷卻的抗凝管中搖勻,在試管內(nèi)靜止5 min,經(jīng)高速冷凍離心機(jī)分離血清,以3000 r/min,離心10min,分離上清,于-20℃保存,待測(cè)生化指標(biāo)。

1.5 血液 HO-1及碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin,COHb)測(cè)定 HO-1測(cè)定采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法,按武漢中美科技有限公司試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用雙波長(zhǎng)法測(cè)定血液COHb:新鮮血加入Na2S2O4,使樣品中多組分的血紅蛋白轉(zhuǎn)化為Hb和COHb兩個(gè)組分,在752型分光光度計(jì)上,用420 nm和432 nm兩個(gè)波長(zhǎng)測(cè)定吸光度,依比爾定律建立綜合方程式,求出全血 COHb的含量百分比。

1.6 血清MDA、SOD ox-LDL測(cè)定 SOD活性測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法,MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法,均嚴(yán)格按照南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,ox-LDL采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法,按尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)(北京)有限公司試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后3周超聲心動(dòng)圖參數(shù) 心衰組、氯化血紅素組大鼠術(shù)后3周時(shí)(尚未給予氯化血紅素)超聲心動(dòng)圖證實(shí)心臟結(jié)構(gòu)已有改變,但心臟功能尚未受到明顯影響(表1)。

表1 術(shù)后3周超聲心動(dòng)圖參數(shù)(±s,n=21)

表1 術(shù)后3周超聲心動(dòng)圖參數(shù)(±s,n=21)

注:Hm:氯化血紅素;IVS:舒張末室間隔厚度;LVPWT:舒張末左室后壁厚度;LVM:左室質(zhì)量;LVEF:左室射血分?jǐn)?shù);LVFS:左室短軸縮短率。與對(duì)照組比較,*P＜0.01

組別 IVS(mm)LVPWT(mm)LVM(mg)LVEF(%)LVFS(%)對(duì)照組 1.44±0.11 1.41±0.15 487±137 77±11 41±11心衰組 1.96±0.14*1.89±0.19*836±135*74±10 38±9 Hm 組 1.96±0.18*1.9±0.31*769±126*74±11 38±8

2.2 血清中 HO-1含量及COHb比值 心衰組HO-1含量與對(duì)照組相比在8周、12周時(shí)明顯增高,分別為(4.50±0.29)μ g/L vs(1.60±0.64)μ g/L;(6.07±0.71)μ g/L vs(1.92±0.56)μ g/L(均P ＜0.01)。氯化血紅素組與心衰組相比HO-1含量4、8、12周時(shí)均明顯升高,分別為(6.80±0.92)μ g/L vs(2.50±0.22)μ g/L;(10.70±0.69)μ g/L vs(4.50±0.28)μ g/L;(13.30±0.99)μ g/l vs(6.07±0.71)μ g/L(均 P ＜0.01;圖 1)。

圖1 各組大鼠不同時(shí)期血清中HO-1含量

心衰組與對(duì)照組相比COHb比值在8、12周時(shí)明顯升高,分別為(2.46±0.20)%vs(1.57±0.12)%;(3.01±0.42)%vs(1.40±0.18)%(P ＜0.01)。氯化血紅素組與心衰組相比4、8、12周時(shí)COHb比值明顯升高,分別為(4.34±0.31)%vs(1.68±0.11)%;(6.32±0.44)%vs 2.46±0.2)%;(7.80±0.39)%vs(3.01±0.42)%(P＜0.01;圖2)。

圖2 各組大鼠不同時(shí)期血清中COHb含量

2.3 血清中MDA含量 心衰組MDA含量與對(duì)照組相比在 4、8、12周時(shí)分別升高133%、224%、122%(均P＜0.01)。氯化血紅素組MDA含量與心衰組相比在4、8、12周時(shí)分別降低41%(P＜0.05)、52%(P＜0.01)、55%(P ＜0.01;表2)。

表2 各組大鼠不同時(shí)期血清中MDA含量(μ mol/L,n=7,±s)

表2 各組大鼠不同時(shí)期血清中MDA含量(μ mol/L,n=7,±s)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.01;與心衰組比較,△P＜0.05,#P＜0.01

組別 4周 8周 12周對(duì)照組 6.1±0.7 6.2±0.8 6.5±1.2心衰組 14.2±2.3* 20.2±3.2* 26.1±3.7*Hm 組 8.3±1.3△ 9.6±0.5# 11.8±1.1#▲

2.4 血清中SOD活性 心衰組SOD活性與對(duì)照組相比 4、8、12 周時(shí)分別降低40%、56%、75%(均P＜0.01)。氯化血紅素組SOD活性與心衰組相比4、8、12 周時(shí)分別升高 31%、62%、81%(均 P ＜0.01;表 3)。

表3 各組大鼠不同時(shí)期血清中SOD活性(kU/L,n=7±s)

表3 各組大鼠不同時(shí)期血清中SOD活性(kU/L,n=7±s)

注:SOD:超氧化物歧化酶,其他縮寫見(jiàn)表1注。與對(duì)照組比較,*P＜0.01;與心衰組比較,#P＜0.01

組別 4周 8周 12周對(duì)照組 159±8 153±11 155±11心衰組 95±10* 67±5* 40±6*Hm 組 125±6# 109±9# 72±10#

2.5 各組大鼠血清中ox-LDL含量 心衰組ox-LDL含量與對(duì)照組相比 4、8、12周時(shí)分別升高112%、207%、382%(均 P＜0.01)。氯化血紅素組ox-LDL含量與心衰組相比4、8、12周時(shí)分別降低37%、40%、42%(均 P ＜0.01;表 4)。

表4 各組大鼠不同時(shí)期血清中ox-LDL含量(μ mol/L,n=7,±s)

表4 各組大鼠不同時(shí)期血清中ox-LDL含量(μ mol/L,n=7,±s)

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.01;與心衰組比較,#P＜0.01

組別 4周 8周 12周對(duì)照組 0.85±0.16 0.76±0.16 0.65±0.14心衰組 1.80±0.22* 2.34±0.25* 3.17±0.31*Hm組 1.14±0.16# 1.38±0.14# 1.83±0.16#

3 討 論

經(jīng)胃腸道給予Hm能對(duì)體內(nèi)HO/CO-膽紅素系統(tǒng)起到誘導(dǎo)作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到在壓力負(fù)荷性心力衰竭的形成過(guò)程中體內(nèi)HO/CO-膽紅素系統(tǒng)活性較正常情況下增強(qiáng),經(jīng)胃腸道給予血紅素后,血液中HO-1、COHb含量在 4周、8周、12周時(shí)均明顯增高,說(shuō)明胃腸道可以成為對(duì)HO/CO-膽紅素系統(tǒng)進(jìn)行外源性干預(yù)的有效途徑。Hm作為HO的底物和誘導(dǎo)劑,在許多離體和在體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已廣泛應(yīng)用,但以往的在體實(shí)驗(yàn)均經(jīng)腹腔注射,本實(shí)驗(yàn)選用的Hm是從牛血中提取的,在胃腸道吸收率高,目前臨床上用于防治缺鐵性貧血,被認(rèn)為是效果好的生物鐵源,無(wú)鐵腥味,不刺激胃,本實(shí)驗(yàn)采用灌胃方法,未觀察到不良反應(yīng),并對(duì)體內(nèi)的HO/CO-膽紅素系統(tǒng)起到了持續(xù)有效的誘導(dǎo)作用,這種誘導(dǎo)作用至少可以持續(xù)12周,為臨床上長(zhǎng)期應(yīng)用Hm誘導(dǎo)HO-1/CO-膽紅素系統(tǒng)的臨床需要提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

大量研究資料表明,心衰發(fā)生發(fā)展過(guò)程中機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激[4,5]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的一種終末物,可以反映機(jī)體自由基水平。SOD是體內(nèi)酶類自由基清除劑,其血清活性高低可以反映機(jī)體自由基清除能力。ox-LDL是 LDL中不飽和脂肪酸雙鍵在氧自由基作用下形成的過(guò)氧化物,也可以反映體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。HO/CO-膽紅素系統(tǒng)代謝過(guò)程中,膽紅素、膽綠素、鐵離子均是體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì),其中尤以膽紅素抗氧化能力最強(qiáng),其抗氧化能力甚至比谷胱甘肽強(qiáng)一萬(wàn)倍,作為保護(hù)細(xì)胞免遭氧化脅迫的一條極佳途徑,膽紅素可能是進(jìn)化的重要產(chǎn)物[1]。膽紅素分子具有特殊卷曲結(jié)構(gòu)和不對(duì)稱性,在血漿中與白蛋白結(jié)合后,促使膽紅素C-10上的氫轉(zhuǎn)化為活性氫原子,極易與超氧陰離子等自由基反應(yīng),從而具有清除自由基的功能,體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)膽紅素能阻止LDL被2,2,-偶氮(2-丙基脒)的雙鹽酸鹽在37℃產(chǎn)生的氧自由基氧化修飾,從而抑制ox-LDL的形成;在體內(nèi)也證實(shí)膽紅素由于含有延伸的共軛雙鍵系統(tǒng)和活性氫原子,從而能夠阻止氧化作用,抵抗LDL被氧化,從而抑制ox-LDL的形成。此外有研究結(jié)果提示,ox-LDL的氧化修飾并不完全取決于LDL膽固醇的含量,而是主要取決于內(nèi)源性抗氧化劑膽紅素的含量[6]。本實(shí)驗(yàn)中心衰組血漿MDA含量隨術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增高,SOD活性則不斷下降,證實(shí)了在心衰形成過(guò)程中,機(jī)體氧化與抗氧化處于失衡狀態(tài),自由基清除不足,體內(nèi)產(chǎn)生了持續(xù)的氧化應(yīng)激,這與Nain等[6]的研究結(jié)果一致。與此同時(shí),ox-LDL含量進(jìn)行性上升,可在一定程度上反映機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。給予Hm后,血清SOD不同程度升高,MDA、ox-LDL不同程度地降低,提示HO/CO-膽紅素系統(tǒng)誘導(dǎo)成功,對(duì)機(jī)體起到了抗氧化的保護(hù)作用,在一定程度上改變了體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。T urkseven等[7]在實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠探討HO-1的抗氧化機(jī)制中發(fā)現(xiàn),HO-1被誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞SOD水平增加,認(rèn)為HO-1抗氧化應(yīng)激的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用需要內(nèi)皮細(xì)胞SOD的參加。但SOD增高的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí),經(jīng)胃腸道給予Hm可以對(duì)體內(nèi)的HO-1產(chǎn)生誘導(dǎo)作用;Hm-HO-1/CO-膽紅素系統(tǒng)的誘導(dǎo)可改善壓力負(fù)荷心衰大鼠的體內(nèi)氧化/抗氧化失衡狀態(tài)。

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