聶 海,賴西南,黃顯凱,王麗麗

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院:1.野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷、燒傷和復(fù)合傷國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第六研究室;2.醫(yī)院全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷中心,重慶400042)

現(xiàn)代戰(zhàn)爭爆炸性武器的大量使用和平時(shí)意外突發(fā)性爆炸事件的頻繁發(fā)生[1],導(dǎo)致爆炸性損傷有增多趨勢(shì)[2],而爆炸事件大部分發(fā)生在相對(duì)密閉空間如戰(zhàn)斗艙室、汽車、地鐵、煤窯等,其物理性質(zhì)與開闊地爆炸不盡相同。在爆炸性損傷中,腹部爆炸傷發(fā)生率較高[2]。研究表明,相對(duì)密閉空間腹部爆炸傷較開闊地爆炸傷情更嚴(yán)重[3],腸道氧化應(yīng)激反應(yīng)更劇烈[4]。爆炸傷可引起腸道缺血缺氧、氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),但是否可導(dǎo)致內(nèi)毒素移位尚不清楚。本研究試圖通過艙室模擬器內(nèi)爆炸建立致傷模型,觀察艙內(nèi)大鼠腹部爆炸傷后血漿內(nèi)毒素的動(dòng)態(tài)變化,為早期診斷腸源性感染和相對(duì)密閉空間爆炸傷員的合理救治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 復(fù)制動(dòng)物模型及采集標(biāo)本 100只230g左右健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為艙內(nèi)組、艙外組,每組50只。速眠新Ⅱ(長春軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所提供)0.4mL/kg體重進(jìn)行股部肌肉注射麻醉。將大鼠固定于艙室,用600mg DDNP紙質(zhì)點(diǎn)爆源懸掛于陸軍模擬戰(zhàn)斗艙室(第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所研制)中央,爆心距離大鼠腹部中央10cm引爆,爆炸后立即將大鼠取出艙室。爆炸后觀察大鼠胸、腹壁有無穿透?jìng)?、貫通傷、盲管?如有開放性損傷則剔除,致傷后3、8、24、48h和 72h處死大鼠按要求采集門靜脈血和腹主動(dòng)脈血標(biāo)本,另采集10只未致傷的正常大鼠血標(biāo)本。

表1 外周血內(nèi)毒素水平變化情況(Eu/mL

表1 外周血內(nèi)毒素水平變化情況(Eu/mL

與致傷前比較,*:P＜0.05,#:P＜0.01;與艙外組比較,△:P＜0.05,▲:P＜0.01。

傷后時(shí)間(h)組別 傷前3 8 24 48 72艙內(nèi)組 0.077±0.019 0.267±0.052# 0.424±0.084#△ 0.553±0.065#▲ 0.602±0.182#▲ 0.598±0.198#▲艙外組 0.077±0.019 0.208±0.067* 0.332±0.080# 0.381±0.129# 0.344±0.093# 0.270±0.119#

表2 門靜脈血內(nèi)毒素水平變化情況(Eu/mL

表2 門靜脈血內(nèi)毒素水平變化情況(Eu/mL

與致傷前比較,*:P＜0.05,#:P＜0.01;與艙外組比較,△:P＜0.05,▲:P＜0.01。

傷后時(shí)間(h)組別 傷前3 8 24 48 72艙內(nèi)組 0.077±0.011 0.527±0.151#△ 0.648±0.152#▲ 0.782±0.152#▲ 0.865±0.130#▲ 0.706±0.159#▲艙外組 0.077±0.011 0.380±0.095# 0.474±0.098# 0.580±0.160# 0.570±0.100# 0.483±0.087#

1.2 檢測(cè)內(nèi)毒素 采用改良基質(zhì)顯色鱟試劑[5]法檢測(cè)血漿內(nèi)毒素水平(上海伊華臨床醫(yī)學(xué)科技公司),根據(jù)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)求得內(nèi)毒素含量。

1.3 檢測(cè)血IL-6和TNF-α水平 采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)OD值,根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得血漿IL-6[6]和 TNF-α濃度[7],實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒(晶美生物工程有限公司)說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 外周血內(nèi)毒素水平變化 大鼠腹部爆炸傷后血漿內(nèi)毒素水平在3h開始升高,與傷前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艙內(nèi)組 48h達(dá)高峰,艙外組 24h達(dá)峰值;艙內(nèi)組血漿內(nèi)毒素水平較艙外組升高快,且持續(xù)時(shí)間長,傷后8h艙內(nèi)組明顯高于艙外組,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),致傷后72h仍明顯高于艙外組,見表1。總體來說,艙內(nèi)組與艙外組比較內(nèi)毒素水平明顯上升(t=4.153,P＜0.001)。

2.2 門靜脈血內(nèi)毒素水平變化 大鼠腹部爆炸傷后血漿內(nèi)毒素水平在3h開始升高,與傷前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艙內(nèi)組 48h達(dá)高峰,艙外組 24h達(dá)峰值;艙內(nèi)組血漿內(nèi)毒素水平較艙外組升高快,且持續(xù)時(shí)間長,傷后8h艙內(nèi)組明顯高于艙外組,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),到傷后72h仍明顯高于艙外組,見表2。艙內(nèi)組門靜脈血內(nèi)毒素水平較艙外組明顯升高(t=4.818,P＜0.001)。

2.3 外周血和門靜脈血內(nèi)毒素水平比較 相同時(shí)間點(diǎn)門靜脈血和外周血內(nèi)毒素水平比較發(fā)現(xiàn),門靜脈血內(nèi)毒素水平較外周血升高快且明顯,但24h后組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表3。

表3 同一時(shí)間點(diǎn)外周血和門靜脈血內(nèi)毒素水平比較

2.4 外周血TNF-α水平變化 艙內(nèi)組大鼠腹部爆炸傷后血漿TNF-α水平在傷后3h內(nèi)即開始快速升高,且明顯高于艙外組,與傷前、艙外組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艙內(nèi)組48h、艙外組24h達(dá)峰值;艙內(nèi)組血漿內(nèi)毒素水平較艙外組升高快,且持續(xù)時(shí)間長,傷后72h仍明顯高于艙外組,見表4?？傮w來說,艙內(nèi)組與艙外組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.492,P＜0.001)。

2.5 外周血IL-6水平變化 艙內(nèi)組大鼠腹部爆炸傷后血漿IL-6水平在傷后8h內(nèi)開始升高,明顯高于艙外組,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);艙內(nèi)組48h、艙外組24h達(dá)高峰;艙內(nèi)組血漿IL-6水平較艙外組升高快,且持續(xù)時(shí)間長,傷后72h仍明顯高于艙外組,見表5?？傮w來說,艙內(nèi)組與艙外組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.513,P=0.013)。

表4 外周血血漿 TNF-α水平變化(ng/mL

表4 外周血血漿 TNF-α水平變化(ng/mL

與致傷前比較,*:P＜0.05,#:P＜0.01;與艙外組比較,△:P＜0.05,▲:P＜0.01。

傷后時(shí)間(h)組別 傷前3 8 24 48 72艙內(nèi)組 0.58±0.06 1.03±0.09#△ 1.67±0.21#△ 2.67±0.26#△ 2.80±0.35#▲ 2.41±0.22▲艙外組 0.58±0.06 0.78±0.11 1.39±0.22# 2.14±0.51# 2.14±0.47# 1.78±0.32#

表5 外周血血漿IL-6水平變化(pg/mL

表5 外周血血漿IL-6水平變化(pg/mL

與致傷前比較,*:P＜0.05,#:P＜0.01;與艙外組比較,△:P＜0.05,▲:P＜0.01。

傷后時(shí)間(h)組別 傷前3 8 24 48 72艙內(nèi)組 96.4±16.8 126.9±20.6 275.4±40.3#△ 323.3±32.6#▲ 265.5±33.8#▲ 216.6±27.8#▲艙外組 96.4±16.8 118.2±18.8 228.8±20.8# 238.0±30.2# 162.0±17.7# 137.7±20.5#

圖1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.6 門靜脈血內(nèi)毒素水平與外周血內(nèi)毒素、IL-6、TNF-α水平的相關(guān)性 相關(guān)分析表明,門靜脈血內(nèi)毒素水平與外周血漿內(nèi)毒素、IL-6、TNF-α呈正相關(guān),見表 6。

表6 門靜脈血內(nèi)毒素水平與外周血漿指標(biāo)的關(guān)系

3 討 論

正常大鼠由于腸道屏障功能的作用,血液循環(huán)中僅含有極微量的內(nèi)毒素,但不會(huì)對(duì)機(jī)體造成危害,因?yàn)樯砬闆r下,即使有少量內(nèi)毒素入血,由于肝臟的強(qiáng)大解毒屏障功能,內(nèi)毒素也很容易被體內(nèi)防御系統(tǒng)清除。本研究結(jié)果顯示,不管是門靜脈血還是外周血內(nèi)毒素水平艙內(nèi)組均明顯高于艙外組,而且水平更高、持續(xù)時(shí)間更長,表明艙內(nèi)組的腸源性內(nèi)毒素血癥發(fā)生早且持續(xù)更久,相對(duì)密閉空間爆炸傷員機(jī)體發(fā)生腸源性內(nèi)毒素血癥的可能性大;此外,門靜脈血內(nèi)毒素水平與外周血變化趨勢(shì)基本一致,提示在大鼠腹部爆炸傷后檢測(cè)外周血內(nèi)毒素水平可以近似反映腸道內(nèi)毒素移位。外周血血漿 TNF-α和IL-6水平變化趨勢(shì)與內(nèi)毒素水平變化基本一致,提示通過檢測(cè)外周血TNF-α和IL-6水平間接判斷是否存在腸道內(nèi)毒素移位,艙內(nèi)組腹部爆炸傷后全身炎癥反應(yīng)較艙外組重,且持續(xù)時(shí)間長,可能更易發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征,進(jìn)而導(dǎo)致多器官功能衰竭(MODS)。但 TNF-α水平較 IL-6升高早、上升速度快,而且維持在較高水平,這種差異可能反映了這些細(xì)胞因子在全身炎癥反應(yīng)中所起不同的作用:TNF-α是早期表達(dá)的致炎介質(zhì),它誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生與IL-6在體內(nèi)產(chǎn)生免疫協(xié)同作用;而IL-6后續(xù)產(chǎn)生對(duì)炎癥進(jìn)一步發(fā)展起促進(jìn)作用。

本研究還發(fā)現(xiàn),在相同時(shí)間點(diǎn)外周血內(nèi)毒素水平較門靜脈血低,表明腸道內(nèi)毒素通過腸黏膜屏障進(jìn)入門靜脈血,通過肝臟的解毒、過濾功能,降低門靜脈血內(nèi)毒素水平,進(jìn)入外周血的內(nèi)毒素減少,導(dǎo)致外周血內(nèi)毒素水平較門靜脈血低;而傷后48h后門靜脈血內(nèi)毒素水平和外周血比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,可能是由于肝臟已經(jīng)發(fā)揮最大的清除內(nèi)毒素潛能,導(dǎo)致二者水平相近,也可能是由于大鼠腸道功能開始恢復(fù),腸黏膜上皮功能改善,腸道通透性降低,內(nèi)毒素吸收減少,而外周血中仍有殘余內(nèi)毒素,導(dǎo)致二者無明顯差異。

因此作者認(rèn)為,大鼠在腹部爆炸時(shí)一方面由于沖擊波的直接作用導(dǎo)致腸道受損,腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生缺血、缺氧,腸道發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[4],導(dǎo)致腸黏膜通透性增加,內(nèi)毒素容易逸出腸壁進(jìn)入血液循環(huán);此外,爆炸傷時(shí)也可發(fā)生細(xì)菌移位(另文報(bào)道),細(xì)菌在血循環(huán)中發(fā)生死亡、降解也可以釋放大量內(nèi)毒素,使血中內(nèi)毒素水平進(jìn)一步升高,形成內(nèi)毒素血癥。當(dāng)血中細(xì)菌內(nèi)毒素持續(xù)升高時(shí),一方面通過直接激活單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)及中性粒細(xì)胞,誘導(dǎo)其分泌多種介質(zhì)如TNF-α、IL-1和 IL-6等[8],通過這些介質(zhì)在局部或循環(huán)中播散至機(jī)體其他部分而發(fā)揮效應(yīng)作用。另一方面內(nèi)毒素與內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合后,可明顯增加巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌吞噬以及促進(jìn)TNF-α分泌[9]。TNF-α是炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因子,主要參與宿主對(duì)膿毒血癥、創(chuàng)傷和MODS的反應(yīng)。促進(jìn)TNF-α產(chǎn)生的病原有許多,其中內(nèi)毒素最引人注意,它能同時(shí)激活TNF的轉(zhuǎn)錄和翻譯,并促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α。當(dāng)細(xì)菌或病毒進(jìn)入機(jī)體后TNF-α在循環(huán)中出現(xiàn)較早并迅速達(dá)到高峰,它可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放IL-6,而IL-6隨后又刺激其他細(xì)胞因子的生物合成,并反過來增強(qiáng)組織細(xì)胞對(duì)TNF-α的敏感性,參與或調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng),可作為反映機(jī)體炎癥與疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)。

綜上所述,腹部爆炸傷后沖擊波作用導(dǎo)致腸黏膜缺血缺氧、發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),增加腸黏膜通透性,促進(jìn)大量內(nèi)毒素移位,發(fā)生內(nèi)毒素血癥,然后激活炎癥細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì),炎癥介質(zhì)又放大內(nèi)毒素的作用,導(dǎo)致體內(nèi)免疫異常,直接或間接地引起或加重器官功能損害,甚至引起死亡,因此內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)在腹部爆炸傷后判斷病情嚴(yán)重程度和繼發(fā)器官功能受損中起著重要的作用,因此了解內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)的致病機(jī)制及其作用特點(diǎn),對(duì)臨床上選擇有效防治MODS的方法具有重要的意義[10-11];在臨床上測(cè)定腹部爆炸傷傷員血漿內(nèi)毒素水平和炎癥介質(zhì),既可以準(zhǔn)確判斷傷情,盡早判斷預(yù)后,又可以判斷藥物干預(yù)的效果,適時(shí)調(diào)整治療方案,對(duì)促進(jìn)合理用藥和提高患者預(yù)后及生活質(zhì)量有重要意義。

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