吳春蓉,李生陸,羅治彬

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 400010;2.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科 401520)

腫瘤是目前對(duì)人類(lèi)生命和健康危害最嚴(yán)重的疾病之一。腫瘤發(fā)生、發(fā)展的確切機(jī)制仍未完全闡明,一類(lèi)新的非蛋白質(zhì)編碼微小RNA(microRNA,miR)的出現(xiàn)為腫瘤研究提供了新的思路。miR是一類(lèi)長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸的非編碼的單鏈RNA分子。它通過(guò)與靶mRNA完全或不完全地互補(bǔ)配對(duì),促進(jìn)目標(biāo)mRNA降解或抑制蛋白翻譯,在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因調(diào)控及腫瘤的發(fā)生中扮演重要的角色。研究特定miR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用正成為腫瘤研究的一個(gè)新的熱點(diǎn)。

2005年Altuvia等[1]首次發(fā)現(xiàn) miR-451。2009年 Bandres等[2]研究發(fā)現(xiàn)miR-451與預(yù)后不良相關(guān)。與無(wú)瘤組織相比,原位雜交顯示胃癌和結(jié)腸癌上皮細(xì)胞miR-451表達(dá)降低。胃癌細(xì)胞AGS和結(jié)腸癌上皮細(xì)胞DLD1 miR-451過(guò)表達(dá)則降低細(xì)胞擴(kuò)增及增加放射敏感性。微陣列及生物信息學(xué)分析鑒別出新的致癌基因巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)是miR-451的潛在靶點(diǎn)。而MIF是參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要因子[3-4]。2010年Godlewski等[5]研究miR-451表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤遷移的影響。球體實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及小室侵襲實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)miR-451降低球體遷移,深入研究發(fā)現(xiàn)miR-451通過(guò)影響細(xì)胞骨架而調(diào)控遷移。但miR-451是否影響胃腸癌細(xì)胞侵襲能力還未被研究。本課題將化學(xué)合成的miR-451 mimics轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480細(xì)胞,觀察其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人源性結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480(CCL-228,ATCC)為重慶醫(yī)科大學(xué)張貴海博士饋贈(zèng)。特級(jí)胎牛血清購(gòu)自北京元亨圣馬生物科技公司,新生牛血清購(gòu)自杭州四季青公司,Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基購(gòu)自北京邁晨基因公司,轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體lipofectamine2000(簡(jiǎn)稱(chēng)lipo2000)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,Opti-M EMⅠ低血清培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所,人miR-451 mimics、陰性控制及Cy3標(biāo)記的轉(zhuǎn)染效率控制購(gòu)自廣州銳博公司(RiBoBio),Matrigel購(gòu)自BD Bioseience公司,Transwell侵襲小室(8 μ m 孔徑)購(gòu)自Millipore公司,細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Costar公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞均在37℃、無(wú)CO2、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng),選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分組:(1)miR-451轉(zhuǎn)染組,加入合成的成熟型miR-451 100 nmol/L(終濃度為100 nM)和相應(yīng)劑量的脂質(zhì)體;(2)Negative組,加入無(wú)關(guān)序列和脂質(zhì)體;(3)脂質(zhì)體組,僅加入脂質(zhì)體;(4)對(duì)照組,無(wú)任何轉(zhuǎn)染。

1.3.1 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 轉(zhuǎn)染前24 h接種SW480于24孔板,待生長(zhǎng)至30%～50%匯合時(shí),Opti-MEMⅠ釋轉(zhuǎn)染試劑 li-po2000,另用 Opti-M EMⅠ分別稀釋不同劑量的 siR-RiboTMTransfection Control(Cy3),使轉(zhuǎn)染時(shí)終濃度分別為 50、80、100、120 nM;室溫孵育 5 min;將二者輕輕混合,室溫培養(yǎng) 20 min以形成Transfection Control(Cy3)-lipo2000混合物,再加入含有細(xì)胞及培養(yǎng)液的24孔板中,輕晃均勻;將培養(yǎng)板置于37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后用熒光倒置相差顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況。整個(gè)操作過(guò)程嚴(yán)格遵循RNA操作相關(guān)規(guī)則,并且避光。胎盤(pán)藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。

1.3.2 miR-451 mimics/Negative轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前 24 h接種SW480于6孔板,待生長(zhǎng)至 30%～50%匯合時(shí),取miR-451 mimics/Negative 10 μ L 、脂質(zhì)體 5 μ L,分別經(jīng) Opti-MEM 稀釋至250 μ L,于室溫中作用 5 min后將兩者緩緩混合,靜置 20 min,加入SW480中搖晃混勻。培養(yǎng)6 h后,換含 10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)24～48 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另設(shè)單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組,未轉(zhuǎn)染細(xì)胞做對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 CCK-8檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖能力 按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將SW480細(xì)胞按4×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板(每孔100 μ L)中,待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染,分別于轉(zhuǎn)染后(24、48、72 h)加入 CCK-8 10μL,37 ℃、5%CO2培養(yǎng) 2 h,酶標(biāo)儀測(cè)定D450值。每個(gè)處理組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。重復(fù)3次。

1.5 miR-451 mimics對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響 用流式細(xì)胞儀分析腫瘤細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)染后48 h用胰酶消化細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,離心。PBS洗2次后用PBS重懸,充分吹打。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL,加入 10 μ L Annexin V-FITC和10 μ L PI,混勻,進(jìn)行流式細(xì)胞儀(BD FACS Vantage)檢測(cè)。Annexin V陽(yáng)性/PI陰性判斷為早期凋亡,Annexin V陽(yáng)性/PI陽(yáng)性判斷為晚期凋亡。二者合并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 侵襲能力檢測(cè) 腫瘤細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn):用50 mg/L基質(zhì)膠(BD公司)1∶4稀釋液包被8 μ m 孔徑 Transwell小室濾膜的上表面,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育 1 h,用 L-15水化小室濾膜上、下表面。消化收集轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞,離心棄去培養(yǎng)液,用PBS洗 1～2遍,用含0.1%BSA的 L-15培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/mL的細(xì)胞懸液。24孔板中放置Transwell侵襲小室,先在小室上層分別加入事先制備好的4組細(xì)胞懸液200 μ L,輕輕搖勻。再向下室加入600μL含 10%FBS的L-15培養(yǎng)液。置24孔板于 37℃、無(wú)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后從孔板中移出小室,用脫脂棉拭去小室濾膜上層未通過(guò)微孔的細(xì)胞,將此濾膜先于 4%多聚甲醛中固定 30 min,1%結(jié)晶紫染色10 min,使侵襲到濾膜下層的細(xì)胞充分著色呈紫藍(lán)色,輕輕洗滌殘余染料,倒置顯微鏡觀察并拍照,每組隨機(jī)選擇5個(gè)視野,計(jì)數(shù)。并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示,進(jìn)行正態(tài)性分析及方差齊性檢驗(yàn),多組間比較應(yīng)用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加,轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的熒光增多,而終濃度為 100、120 nM 時(shí),轉(zhuǎn)染效率都高(約 80%～90%)(見(jiàn)彩插Ⅰ 圖 1)。50、80、100 nM 組死細(xì)胞都極少,而120 nM組死細(xì)胞增加,提示隨著轉(zhuǎn)染劑量增加,細(xì)胞毒性也增加,所以選擇100 nM終濃度為實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染miR mimics/Negative的優(yōu)化濃度。

2.2 miR-451 mimics對(duì)SW480增殖能力的影響 各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較為相似,增殖速度無(wú)明顯差別(圖2)。

圖2 miR-451 mimics(100 nM)轉(zhuǎn)染對(duì)SW480細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 miR-451 mimics對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(5.81±1.20)%,Negative組細(xì)胞凋亡率為(9.57±2.92)%,miR-451轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(6.33±2.89)%,脂質(zhì)體組細(xì)胞凋亡率為(5.60±2.63)%。各組細(xì)胞間凋亡發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 細(xì)胞侵襲能力 對(duì)照組細(xì)胞具有一定的侵襲能力,48 h通過(guò)8 μ m 孔徑的細(xì)胞數(shù)為(33±7)個(gè)。miR-451轉(zhuǎn)染組為(17±2)個(gè),Negative組為(29±5)個(gè),脂質(zhì)體組為(31±7)個(gè)。Negative組、脂質(zhì)體組侵襲能力與對(duì)照組一致,miR-451轉(zhuǎn)染組最低(見(jiàn)彩插Ⅰ圖 3)。

3 討 論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜過(guò)程。包括各種黏附相關(guān)分子、蛋白水解酶類(lèi)、許多細(xì)胞因子及調(diào)節(jié)因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)基因和一些癌基因、抑癌基因等。miR參與對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子的基因表達(dá)調(diào)控研究已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。在大多數(shù)高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞系(如MDA-MB-231)中,miR-126和miR-335表達(dá)缺失,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法恢復(fù)miR-126或miR-335的表達(dá)可以使癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性減少80%。Tavazoie等[6]證明細(xì)胞形態(tài)的改變與減少細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性有關(guān),它限制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。miR-335負(fù)調(diào)控組與腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶基因,這些靶基因?yàn)樽婕?xì)胞轉(zhuǎn)錄因子SOX4和細(xì)胞外基質(zhì)成分鈣黏蛋白C。Ma等[7]證明 miR-10b的表達(dá)與腫瘤的血管侵襲有關(guān),同時(shí)miR-10b特異性增加腫瘤細(xì)胞的侵襲,但不影響細(xì)胞的生活力和增殖。將過(guò)表達(dá)miR-10b的乳腺癌細(xì)胞系SUMl59注射到小鼠乳房脂肪細(xì)胞中可以觀察到腫瘤細(xì)胞簇的肺部微小轉(zhuǎn)移,并有部分細(xì)胞轉(zhuǎn)移到胸膜。Sengupta等[8]應(yīng)用芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-29c在鼻咽癌中的表達(dá)是正常鼻咽組織的1/5。進(jìn)一步研究表明,miR-29c調(diào)控的基因?yàn)榧?xì)胞外基質(zhì)蛋白,包括膠原和層粘連蛋白γ1,它們參與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移。miR與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的研究也備受關(guān)注[9]。影響結(jié)腸癌預(yù)后的主要因素為結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移情況,因此研究與結(jié)腸癌侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的特定miR具有重要意義。

miR-451是一個(gè)多功能miR,已被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。最近研究表明,miR-451具有不同的功能,在多種生理和病理過(guò)程中(如造血系統(tǒng)分化[10]、血液系統(tǒng)疾病[11]、神經(jīng)發(fā)育[12]、心血管疾病[13]、癌癥發(fā)生等)起重要作用。實(shí)驗(yàn)表明,miR-451在多種惡性腫瘤中(如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[14]、胃腸癌[2]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[15]等)異常表達(dá),miR-451還通過(guò)靶向MDR調(diào)控卵巢癌[16]、乳腺癌[17]耐藥。

但此前尚未有miR-451與胃腸癌侵襲具有相關(guān)性的報(bào)道。2010年Godlewski等[5]研究了miR-451表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤遷移的影響。球體實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)及小室侵襲實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)miR-451降低球體遷移,深入研究發(fā)現(xiàn)miR-451通過(guò)影響細(xì)胞骨架而調(diào)控遷移。生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)及熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CAB39是miR-451的一個(gè)功能相關(guān)靶標(biāo)。提示miR-451也有可能在胃腸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。因此,本研究對(duì)miR-451的功能進(jìn)行了進(jìn)一步的研究,通過(guò)功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-451的表達(dá)能夠抑制SW480的侵襲能力。

作者使用siR-RiboTMTransfection Control(Cy3)作為轉(zhuǎn)染效率判斷的間接指標(biāo),其與hsa-miR-451 mimics片段大小相似,但是帶Cy3熒光基團(tuán),在相同的操作條件下,檢測(cè)不同濃度下的轉(zhuǎn)染效率,便于實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染mimics篩選有效劑量,mimics組及negative組未帶熒光基團(tuán),主要考慮后續(xù)實(shí)驗(yàn)中如流式檢測(cè)會(huì)帶來(lái)干擾。本研究結(jié)果顯示,隨著轉(zhuǎn)染劑量的增加,轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的熒光增多,而終濃度為100、120 nM 時(shí),轉(zhuǎn)染效率都高(約80%～90%)。而120 nM時(shí)細(xì)胞毒性增加,作者選擇100 nM作為實(shí)驗(yàn)優(yōu)化劑量。

miR mimics是運(yùn)用化學(xué)方法合成的miR模擬物,能模擬細(xì)胞中miR的高表達(dá)水平,進(jìn)一步增強(qiáng)內(nèi)源miR的調(diào)控作用,進(jìn)行功能獲得性(gain-of-function)研究。本研究通過(guò)直接瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR mimics對(duì)miR-451的功能進(jìn)行檢測(cè),這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于化學(xué)合成miR簡(jiǎn)單、快捷,避免了構(gòu)建表達(dá)載體的步驟,能夠有效提高特定miR的表達(dá),但缺點(diǎn)是增強(qiáng)表達(dá)的持續(xù)時(shí)間較短,而且轉(zhuǎn)染后表達(dá)量到底增高多少、能持續(xù)多久,還有待于熒光定量PCR檢測(cè)。因此,miR-451轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡無(wú)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚不能肯定是miR-451確實(shí)對(duì)SW480細(xì)胞增殖和凋亡無(wú)影響,還是miR-451表達(dá)量太低所致,尚有待于進(jìn)一步探討。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)利用miR轉(zhuǎn)染技術(shù)提高miR-451在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá);采用Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提高miR-451的表達(dá)能夠抑制SW480細(xì)胞的侵襲能力。首次發(fā)現(xiàn)了miR-451在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,為miR作為靶向腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但miR-451是通過(guò)靶向哪個(gè)或者哪些基因而調(diào)控侵襲能力的尚有待于更進(jìn)一步的探討。對(duì)miR及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入理解,以及對(duì)miR功能和相關(guān)靶位點(diǎn)的全面闡明必將給未來(lái)miR在腫瘤臨床、診斷和治療中的應(yīng)用帶來(lái)廣闊前景。

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