肖 亞,黃赤兵,張艮甫,王平賢,范明齊,馮嘉瑜

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院泌尿外二科,重慶400037)

由于免疫抑制劑的發(fā)展以及配型技術(shù)和臨床移植水平的提高,心臟移植近期(術(shù)后1年內(nèi))效果已顯著改善。然而,迄今為止,尚無阻抑慢性排斥發(fā)生和發(fā)展的有效藥物與臨床干預(yù)手段。在對(duì)慢性排斥臨床病例的觀察和實(shí)驗(yàn)研究中,抗原抗體復(fù)合物在移植物的沉積和由此介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞慢性損傷是慢性排斥共同的臨床表現(xiàn)[1-3]。因此,欲抑制心臟移植術(shù)后慢性排斥,則必須干預(yù)B細(xì)胞排斥性抗體形成[4]。本實(shí)驗(yàn)擬探討CD4+CD25+Treg體內(nèi)應(yīng)用對(duì)小鼠心臟移植受體B細(xì)胞功能的影響,研究CD4+CD25+Treg在移植術(shù)后控制排斥反應(yīng),誘導(dǎo)免疫耐受中的作用機(jī)制,為推動(dòng)CD4+CD25+Treg的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器、試劑 Balb/c小鼠30只,雌雄不限,體質(zhì)量20～25 g。C57bl/6小鼠 30只,雌雄不限,體質(zhì)量25～30 g,由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供;FITC-labeled Anti Rat CD8、FITC-labeled Anti Rat CD25(美 國Pharmingen公司);抗FITC抗體——磁珠(百奧科生物技術(shù)有限公司);免疫磁珠分選(MACS)磁力架、auto MACS磁性分離柱(德國Miltenyi公司);IgA、IgG抗體檢測(cè)試劑盒(邁新公司);3H-TdR(中國原子能研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CD4+CD25+Treg供體抗原特異性的誘導(dǎo) 以0.3%戊巴比妥鈉注射液(1 mL/100 g體質(zhì)量)腹腔注射將C57bl/6小鼠麻醉,無菌條件下切取小鼠脾臟,將其剪碎,研磨后過200目篩網(wǎng)及400目尼龍網(wǎng)濾器,以小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞,置于含10%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)液中備用。無菌條件下切取Balb/c小鼠心臟,制備心組織勻漿抗原。將C57bl/6小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞與Balb/c小鼠心臟組織勻漿抗原在37℃、5%CO2條件下混合培養(yǎng)24 h。采用T細(xì)胞純化柱分離供體抗原特異性誘導(dǎo)后的Balb/c小鼠脾臟T細(xì)胞,以CD8-FITC抗體和抗FITC標(biāo)記的磁珠相結(jié)合陰性選擇法剔除CD8+T細(xì)胞,再以CD25-FITC抗體和抗FITC標(biāo)記的磁珠相結(jié)合的陽性選擇法分選獲得CD4+CD25+T細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)所獲細(xì)胞純度[5]。將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106/mL,備用。

1.2.2 小鼠心臟移植模型的建立 以Balb/c小鼠為供體,C57bl/6小鼠為受體建立小鼠心臟移植模型,對(duì)Chenzh的小鼠頸部異位心臟移植模型進(jìn)一步改進(jìn)。方法:在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端將其橫斷,向近心端剖開,將此斷端與供心升主動(dòng)脈吻合,靜脈吻合仍采用端側(cè)吻合的方法。建立了小鼠頸部異位心臟移植模型。術(shù)后通過視診、觸診及心電圖檢查,觀察移植心搏動(dòng)情況。移植受體于術(shù)前及術(shù)后30 min各給予青霉素100萬u/kg各1次,預(yù)防感染。術(shù)后腹腔注射環(huán)孢霉素1.5 mg?kg-1?d-1,連續(xù)10 d。

實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)組(n=8),受體于術(shù)前 1 d、術(shù)后 2周分別經(jīng)尾靜脈注入供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg各1×106;陽性對(duì)照組(n=8),建立小鼠心臟移植模型,術(shù)前、術(shù)后不給予抗排斥措施;空白對(duì)照組(n=8),正常未進(jìn)行心臟移植的C57bl/6大鼠。

1.2.3 心臟移植受體體內(nèi)B細(xì)胞功能的檢測(cè) 于心臟移植術(shù)后1個(gè)月切取小鼠脾臟,分離單個(gè)核細(xì)胞,按試劑盒說明檢測(cè)血清中IgG、IgA水平。以尼龍毛柱分離獲得小鼠B細(xì)胞,將其置于含10%BSA的 RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),以IgM抗體刺激B細(xì)胞增,培養(yǎng) 72 h后摻入3H-TdR(5 uCi/mL),并繼續(xù)培養(yǎng)18 h,以細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞至玻璃纖維膜上,液體閃爍測(cè)定cpm值,判斷各組B細(xì)胞增殖水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以±s表示。統(tǒng)計(jì)方法為單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg純度 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)以免疫磁珠法分離所獲供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg純度為87.3%(圖1),達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 小鼠心臟移植受體IgG、IgA水平的檢測(cè) 正常C57bl/6小鼠外周血IgG水平為(12.58±1.49)g/L,IgA水平為(2.58±0.16)g/L。以Balb/c小鼠為供體,C57bl/6小鼠為受體建立心臟移植模型后,受體在給予CD4+CD25+Treg干預(yù)時(shí)術(shù)后1個(gè)月外周血IgG水平為(12.83±1.60)g/L,IgA水平為(2.61±0.23)g/L。受體在沒有CD4+CD25+Treg干預(yù)時(shí)術(shù)后1月外周血IgG水平為(16.81±1.33)g/L,IgA水平為(3.97±0.41)g/L,3組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg經(jīng)尾靜脈注入受體大鼠體內(nèi)后對(duì)其體內(nèi)的B細(xì)胞的分泌功能產(chǎn)生了明顯的影響。

圖1 免疫磁珠法分離所獲CD4+CD25-T細(xì)胞純度

圖2 各組小鼠脾臟中IgG、IgA水平

2.3 小鼠心臟移植受體B細(xì)胞增殖能力的檢測(cè) 正常C57bl/6小鼠脾臟B細(xì)胞在IgM抗體刺激下培養(yǎng)90 h后cpm值為2 717.39±356.23;以 Balb/c小鼠為供體,C57bl/6小鼠為受體建立心臟移植模型后,受體在給予CD4+CD25+Treg干預(yù)時(shí)脾臟B細(xì)胞在IgM抗體刺激下培養(yǎng)90 h后cpm值為2 351.11±135.09;無CD4+CD25+Treg干預(yù)時(shí)脾臟B細(xì)胞在IgM 抗體刺激下培養(yǎng) 90 h后 cpm值為3 819.80±232.26。3者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)CD4+CD25+Treg進(jìn)入受體體內(nèi)后對(duì)B細(xì)胞的增殖能力產(chǎn)生了顯著的影響。

圖3 B細(xì)胞體外刺激培養(yǎng)增殖水平

2.4 小鼠移植心臟存活情況觀察 實(shí)驗(yàn)組小鼠移植心臟存活時(shí)間為(93.63±14.04)d,長(zhǎng)于陽性對(duì)照組的(72.38±11.08)d,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),提示供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg在受體體內(nèi)能夠特異性地阻斷B細(xì)胞對(duì)移植心臟的免疫反應(yīng),從而達(dá)到控制排斥反應(yīng)程度,誘導(dǎo)免疫耐受,延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間的作用。

表1 實(shí)驗(yàn)組與陽性對(duì)照組小鼠移植心臟存活時(shí)間(d)

3 討 論

同種器官移植中排斥反應(yīng)主要由受體的抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo),這些抗原特異性T細(xì)胞對(duì)移植物不反應(yīng)或低反應(yīng)是誘導(dǎo)耐受的關(guān)鍵。20世紀(jì)90年代初,Qin等[5]發(fā)現(xiàn),采用非清除性抗CD4單抗可使小鼠產(chǎn)生對(duì)移植物的耐受,將耐受小鼠CD4+T細(xì)胞過繼輸入未移植同品系小鼠,可使其獲得對(duì)同基因移植物的耐受,這一過程可連續(xù)傳代,表明過繼輸入的CD4+T細(xì)胞具有特殊的功能,可使受體針對(duì)移植物抗原的T細(xì)胞產(chǎn)生耐受,該現(xiàn)象被稱作傳染性耐受(Infectious tolerance)。但并非所有CD4+T細(xì)胞均具有傳染性致耐受能力,直到近年,才進(jìn)一步明確:該類CD4+T細(xì)胞是一群CD4+CD25+T細(xì)胞,它們通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸機(jī)制“傳染”抗原特異性的抑制信號(hào)給CD4+細(xì)胞,使之成為具有抑制功能的Th,抑制受體抗原特異性CD4+T、CD8+T對(duì)移植抗原的反應(yīng),控制排斥反應(yīng)[6]。器官移植是挽救終末期患者的有效手段,自20世紀(jì)80年代中期,強(qiáng)力免疫抑制劑應(yīng)用于臨床,急性排斥反應(yīng)得到了有效的控制。目前在臨床治療中,慢性排斥反應(yīng)是移植后器官功能喪失的主要原因。因此,探索一條控制慢性排斥反應(yīng)的治療措施已成為器官移植領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。既往的研究證實(shí),抗原抗體復(fù)合物在移植組織上的沉積、輕度的細(xì)胞性排斥和由此引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與激活,并觸發(fā)不適當(dāng)?shù)男迯?fù)反應(yīng)等[1-3]是引起慢性排斥反應(yīng)的主要機(jī)制。其中由移植物抗原刺激啟動(dòng)的體液免疫應(yīng)答生成抗體并由此而形成的抗原抗體復(fù)合物,與通過激活補(bǔ)體和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用,是導(dǎo)致慢性排斥反應(yīng)發(fā)生的最主要致病因素。B細(xì)胞是機(jī)體惟一的抗體形成細(xì)胞,所以欲控制慢性排斥反應(yīng)的主要致病因素——體液免疫應(yīng)答,則必須調(diào)控體液免疫的主要功能執(zhí)行細(xì)胞——B淋巴細(xì)胞[7-10]。迄今,國內(nèi)外在這方面采取的干預(yù)措施有:利用特異性的單克隆或多克隆抗體阻斷受體本身的排斥性抗體與移植物抗原的結(jié)合,或阻斷清除受體排斥性B細(xì)胞等[8]。但這些措施由于有效靶阻率很低、費(fèi)用昂貴,且不良反應(yīng)很多,因此沒有成為也夠不上調(diào)控慢性排斥反應(yīng)的理想的常規(guī)應(yīng)用手段。

在前期實(shí)驗(yàn)中證實(shí),體外淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)中,與CD4+CD25+Treg、供體淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)時(shí)B細(xì)胞功能可明顯受到抑制,表現(xiàn)為細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IgG、IgA水平明顯降低。進(jìn)一步的研究證實(shí)CD4+CD25+Treg對(duì)效應(yīng)性B細(xì)胞的抑制作用主要是通過細(xì)胞間直接接觸機(jī)制發(fā)生作用,TGF-β1和CTLA4在這一機(jī)制中起著一定作用。以供心臟組織勻漿抗原刺激可使受體CD4+CD25+Treg獲得供體抗原特異性,其抑制效應(yīng)性淋巴細(xì)胞對(duì)供體抗原的反應(yīng)能力明顯增強(qiáng),而不影響效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)第3方抗原的免疫應(yīng)答[9]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞具有負(fù)調(diào)B細(xì)胞抗體形成的這一免疫學(xué)特性,使其具備了對(duì)抗慢性排斥反應(yīng)的潛能。基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,作者推測(cè)采用供體特異性的CD4+CD25+Treg細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用,可選擇性阻抑受體內(nèi)的供體反應(yīng)性B細(xì)胞,從免疫應(yīng)答起始階段阻斷供體反應(yīng)性B細(xì)胞產(chǎn)生供體抗原特異性抗體,而不造成對(duì)受體免疫功能的進(jìn)一步阻抑,從而達(dá)到控制慢性排斥反應(yīng)的理想狀態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中,在體使用了供體抗原特異性的CD4+CD25+T reg,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,小鼠心臟移植受體應(yīng)用供體抗原特異性CD4+CD25+T reg后,其外周血血清中 IgG、IgA水平與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,二者均明顯低于陽性對(duì)照組,提示體內(nèi)應(yīng)用的供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg特異性地阻斷了B細(xì)胞對(duì)移植心臟的免疫反應(yīng)。體外刺激實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg在體應(yīng)用后B細(xì)胞的增殖活性明顯降低。

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了供體抗原特異性的CD4+CD25+Treg在體應(yīng)用后對(duì)B細(xì)胞的特異性免疫抑制作用,進(jìn)一步闡明Treg細(xì)胞對(duì)抗慢性移植排斥反應(yīng)的免疫學(xué)機(jī)制,為推動(dòng)抗移植后慢性排斥反應(yīng)的深入研究和對(duì)開發(fā)利用Treg細(xì)胞作為介導(dǎo)其他實(shí)體器官移植耐受的臨床應(yīng)用工具細(xì)胞鋪墊理論、應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)支持基礎(chǔ)。

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