范 紅,程遠(yuǎn)東,孫 哲,呂曉東

(1.鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院干部病房,河南鄭州450052;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科,河南鄭州450052;3.河南省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所,河南鄭州450052)

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種多基因異常所致的血液系統(tǒng)惡性疾病,包括了復(fù)雜的基因突變、缺失、擴(kuò)增、癌基因激活、抑癌基因失活以及融合基因轉(zhuǎn)錄等多種分子生物學(xué)水平的異常?；蛑委煘槠涮峁┝艘环N高度特異性的治療手段,應(yīng)用標(biāo)記基因能夠更準(zhǔn)確地掌握患者接受免疫治療后以及腫瘤特異性殺傷細(xì)胞在體內(nèi)存在、分布及活性等方面的信息[1]。迄今為止,ALL的發(fā)病和或復(fù)發(fā)機(jī)制并未完全清楚,故尋找新的白血病相關(guān)基因一直是這一領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。篩選出表達(dá)異常和功能異常的白血病相關(guān)基因不僅有助于闡明白血病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制,而且為找到新的治療靶位點(diǎn)提供可能[2]。BRD-2是一種與細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)的基因,但其與ALL的相關(guān)性研究報(bào)道很少。本研究對(duì)78例A LL患者BRD-2 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè),探討其在ALL患者中的表達(dá)情況及其與預(yù)后的關(guān)系。

1 臨床資料

1.1 一般資料 2004年1月至2008年12月鄭州大學(xué)附屬第五醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院收治的ALL患者78例,男38例,女40例,中位年齡23歲(14～68歲)。健康對(duì)照外周血 35份,取自異基因干細(xì)胞移植患者的健康供者及健康體檢者,其中男20例,女15例,平均年齡26歲(16～48歲)。

1.2 半定量 RT-PCR 取外周血5 mL或骨髓2 mL,用Ficoll方法收集1×107個(gè)細(xì)胞,細(xì)胞總 RNA用 TRIzol抽提試劑盒提取,-80℃保存。引物均由上海生工生物工程公司合成。BRD-2 上游引物:5′-CTG CCT ATG CTG GCC ZTTC-3′;下游引物:5′-TCC TCC TCG TCC TCC TCA TC-3′;擴(kuò)增長(zhǎng)度455 bp。β-actin 作為內(nèi)參,上游引物:5′-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GGC-3′;下游引物 :5′-CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度271 bp。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):使用 Promega公司ImProm-IITM Reverse Transcription System試劑盒,步驟為:70℃5 min,42℃60 min,25℃5 min。cDNA作為PCR反應(yīng)的模板,-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增:β-actin作為內(nèi)參照與BRD-2基因的引物一起擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μ L,包括 cDNA 1.6 μ L,10×Mg free buffer 2.5μ L,25 mmol/L M gCl21.5 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,BRD-2 上下游引物終濃度為0.4 umol/L,β-actin上下游引物終濃度為0.2 μ mol/L,Taq聚合酶1.5 u,用去離子水補(bǔ)足至25 μ L。擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù):94℃變性5 min,再94℃30 s,62℃30 s,72℃40 s,共28個(gè)循環(huán),循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后使用BIO-RAD凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行分析,用目的基因與β-actin電泳條帶熒光強(qiáng)度的比值來(lái)檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)錄水平。

1.3 治療方法 78例ALL患者均采用VDP方案(長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、潑尼松)、CODP方案(環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、柔紅霉素、潑尼松)[3]誘導(dǎo)化療 2個(gè)療程,其中 40例青少年患者在不同階段接受不同形式的造血干細(xì)胞移植。移植前狀態(tài)包括:第1個(gè)療程達(dá)到完全緩解(CR1)者20例、第2個(gè)療程達(dá)到完全緩解(CR2)者10例、部分緩解(PR)2例、復(fù)發(fā)狀態(tài)8例。移植方式包括:骨髓移植20例、外周血干細(xì)胞移植15例、臍血移植5例。其中非血緣關(guān)系(包括骨髓或臍血)移植15例、親屬間(包括骨髓或外周血干細(xì)胞)移植11例、自體外周血干細(xì)胞移植14例。其余38例患者在VDP、CODP方案基礎(chǔ)上加用中劑量甲氨蝶呤(M TX)、中劑量阿糖胞苷(Ara-C)、鬼臼乙叉甙(Vp16)等鞏固強(qiáng)化治療;CR半年以上者接受巰嘌呤(6-MP)、MTX維持治療;定期應(yīng)用M TX、Ara-C、地塞米松(Dex)二或三聯(lián)鞘內(nèi)注射預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病。

1.4 療效判斷 參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》第2版。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BRD-2 mRNA陽(yáng)性率 78例 ALL患者 BRD-2 mRNA陽(yáng)性率為75.31%,明顯高于健康對(duì)照組(37.14%,P＜0.05)。ALL患者BRD-2 mRNA的表達(dá)水平(0.912±0.137)高于健康對(duì)照組(0.466±0.209,P＜0.01)。見圖1。

圖1 BRD-2 mRNA表達(dá)情況

2.2 3年無(wú)病生存(DFS)率BRD-2 mRNA陰性ALL患者3年DFS率為47.43%,優(yōu)于BRD-2mRNA陽(yáng)性表達(dá)患者(32.55%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。40例肝細(xì)胞移植患者中,CR1期移植組的3年DFS率優(yōu)于CR2、PR、復(fù)發(fā)狀態(tài)移植者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

BRD-2基因是從T細(xì)胞文庫(kù)中克隆出來(lái)的,包括一個(gè)開放閱讀框,編碼的蛋白質(zhì)含754個(gè)氨基酸[3],是促細(xì)胞活化的絲/蘇氨酸激酶,該酶定位于細(xì)胞核。BelAiba等[4]研究表明該酶專一性地存在于胞核內(nèi),細(xì)胞增生時(shí)活性增高,并且發(fā)現(xiàn)在ALL、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)患者該酶的活性也顯著升高。提示這種胞核激酶是信號(hào)傳導(dǎo)通路上的組分之一,在細(xì)胞周期應(yīng)答中發(fā)揮作用,這種功能的發(fā)揮與E2F轉(zhuǎn)錄因子家族相關(guān)[5]。E2F既可控制細(xì)胞的增殖,又能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,既能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生,又能抑制腫瘤的發(fā)生,既有轉(zhuǎn)錄激活作用,又有轉(zhuǎn)錄抑制作用,原因在于E2F的雙重調(diào)節(jié)功能是相互獨(dú)立的,其調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮與其量的水平有很大關(guān)系。Guo等[6]發(fā)現(xiàn)BRD-2是一種新的與人類白細(xì)胞增多癥有關(guān)的蛋白激酶,包括兩個(gè)高度保守的溴結(jié)合區(qū)。BRD-2可促進(jìn)E2F調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)展,該機(jī)制的異常可能是白細(xì)胞增多的遺傳因素。Mungall等[7]的報(bào)道再次證實(shí)BRD-2在白血病患者的白細(xì)胞中活性很高,提示這種酶可能參與了白血病和其他增生性疾病的發(fā)病機(jī)制。

本研究結(jié)論表明,BRD-2基因在ALL患病組表達(dá)水平高于健康對(duì)照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示該基因可能與ALL的發(fā)病有某種相關(guān)性,但其確切機(jī)制及調(diào)控方式仍有待于進(jìn)一步研究。

大部分學(xué)者認(rèn)為,ALL單純化療的長(zhǎng)期生存率低,只要有人類白細(xì)胞抗原(HLA)相合的同胞供者都應(yīng)在CR1期進(jìn)行異基因移植[8]。本組發(fā)現(xiàn)BRD-2 mRNA陽(yáng)性表達(dá)患者的3年DFS率明顯低于BRD-2 mRNA陰性表達(dá)的患者,而且40例患者接受移植,其中異基因移植26例,自體移植14例,結(jié)果顯示,異基因移植的長(zhǎng)期生存率優(yōu)于化療,但由于樣本數(shù)量有限,隨訪時(shí)間較短,還有待大規(guī)模隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)確定ALL的移植適應(yīng)證和移植時(shí)機(jī)。

綜上所述,BRD-2基因異常表達(dá)在ALL的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用,檢測(cè)該基因可作為臨床診斷及預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。但是BRD-2基因是否是一個(gè)新的白血病相關(guān)基因,其在白血病的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)中究竟起什么作用,這些問(wèn)題的解決有待于更深入的實(shí)驗(yàn)研究。

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