林永良,陳良豈,杜榮國,林英卓

(廣東省陽江市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 529500)

胰腺癌是一惡性程度極高,治療效果及預后極差的腫瘤,且發(fā)病率逐年上升[1]。在西方國家已成為惡性腫瘤導致死亡的第四大原因[2]。除手術外,化療是重要的輔助治療手段,尤其對于不能切除的腫瘤,化療是主要的治療手段。吉西他濱是一種核苷類似物,是臨床上應用廣泛并是迄今治療胰腺癌最好的藥物,在緩解癥狀、延長生存時間和提高生存質量等方面發(fā)揮重要作用,特別是在晚期胰腺癌治療中有著無可替代的重要作用[3]。但在腫瘤化療過程中,耐藥現(xiàn)象的存在,尤其是獲得性耐藥,嚴重地阻礙了該化療藥物應用[3-4]。國外研究顯示常用非甾體類抗炎藥阿司匹林能明顯減低抗腫瘤藥物的作用[5]。在此,本研究探討阿司匹林對吉西他濱在胰腺癌細胞上的作用影響以及其中可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞系:人胰腺癌細胞株SW1990經(jīng)美國引進,由上海細胞庫提供。培養(yǎng)條件為高糖達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DM EM)培養(yǎng)基,含10%胎牛血清,37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)。(2)藥品與試劑:吉西他濱由美國禮來公司生產(chǎn)(規(guī)格每支200 mg,批號:FF0E240);阿司匹林(美國Sigma公司),經(jīng)二甲亞砜(DMSO)溶解,并用DMEM培養(yǎng)基稀釋到工作濃度,振蕩助溶,使DMSO的終濃度為0.1%。由于藥物呈酸性,故用2.8%碳酸氫鈉(NaHCO3)(上海生工)調(diào)整pH值到7.2。四氮唑藍(MT T,美國Sigma公司)。煙酸己可堿(Hoechst)33258(美國Sigma公司)。(3)抗體:磷酸化 AKT(SER437),總AKT,磷酸 PI3K p85(Tyr458)/p55(Tyr199),總 PI3Kp85抗體均購于美國CST公司,按1∶1 000稀釋成工作液。

1.2 方法

1.2.1 M TT法檢測吉西他濱對細胞生存率的抑制作用以及細胞對吉西他濱的敏感性實驗取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板,每孔加入 100 μ L共 104個細胞,細胞貼壁加入藥物處理,一定時間后,每孔加入10μ L 5 mg/mL的M TT溶液,繼續(xù)孵育4 h后,吸走上清液,加入100 μ L DMSO溶解紫色結晶,振蕩5 min,應用自動酶標儀測490 nm處吸光度(A)值。并設不加細胞僅加培養(yǎng)基的空白對照組及接種細胞但不加藥物的對照組。按下式計算不同濃度藥物作用下細胞存活率,細胞存活率=(加藥組A值-空白對照組A值)/(對照組A值-空白對照組A值)×100%。每一項實驗重復 3次,繪制濃度-細胞存活率曲線。根據(jù)Microsoft Excel軟件中給出的相應公式求得72 h時抑制50%細胞生長的藥物濃度(IC50)和耐藥系數(shù)(resistance Index,RI),RI=IC50Gem+ASA/IC50Gem。

1.2.2 凋亡細胞的檢測 細胞經(jīng)過處理后,去掉培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次,加入4%多聚甲醛固定30 min,去掉多聚甲醛,加入4 μ g/mL Hoechst 33258溶液孵育5 min,在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。凋亡細胞表現(xiàn)為核固縮,核碎裂以及凋亡小體形成。

1.2.3 蛋白免疫印跡 細胞經(jīng)過處理后,用M-PER(美國Pierce公司)細胞裂解液裂解細胞,加入磷酸酶抑制劑(PHOSTOP,ROCHE)離心取上清液,用二辛可寧酸(BCA)試劑盒(美國Pierce公司)進行蛋白定量,取相同量總蛋白上樣,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,在電轉緩沖液中100 V低溫轉移60 min,所得硝酸纖維膜在4℃孵育一抗過夜,再在室溫下孵育與 HRP-結合的二抗和 HRP-結合的抗生物素抗體(1∶1 000)1 h,最后曝光,拍照并用Gel-Pro auqlyzer軟件進行灰度掃描。

2 結 果

2.1 吉西他濱對SW1990細胞生存率的抑制作用以及阿司匹林對其影響 經(jīng)M TT方法檢測細胞的活性并計算生存率,單用吉西他濱能呈濃度依賴性地降低SW1990細胞的生存率。單用吉西他濱0.4 μ mol/L,72 h即可使細胞的生存率抑制到對照組的50%,實驗所用最大濃度 25 μ mol/L可能使抑制率達90%。吉西他濱對SW1990的IC50為(0.42±0.05)μ mol/L。合用2 mmol/L阿司匹林后,細胞對吉西他濱反應性明顯下降,細胞存活曲線較單用吉西他濱時明顯上移,此時SW1990對吉西他濱的IC50為(25.03±0.04)μ mol/L?？梢?阿司匹林能使SW1990細胞耐受吉西他濱的處理。計算阿司匹林處理后,吉西他濱對 SW1990的RI為 60。細胞經(jīng)藥物處理的存活曲線,見圖1。

2.2 吉西他濱誘導SW1990細胞凋亡以及阿司匹林對凋亡的保護作用 阿司匹林對SW1990耐受吉西他濱的作用,用Hoechst33258染色來檢測細胞的凋亡情況,發(fā)現(xiàn)對照組細胞有少數(shù)細胞發(fā)生自身性凋亡,經(jīng)吉西他濱處理后,大量細胞(56%)發(fā)生細胞核濃縮、碎裂以及產(chǎn)生凋亡小體(封2圖2)。合用阿司匹林后,吉西他濱這種促凋亡作用被大大減弱,發(fā)生凋亡的細胞數(shù)較單用吉西他濱組下降28%。可見阿司匹林能明顯使細胞耐受吉西他濱引起的凋亡,見圖3。

圖1 細胞經(jīng)不同藥物處理72 h后活性的變化

2.3 阿司匹林激活細胞PI3K/AKT促存活通路 用蛋白免疫印跡的方法檢測阿司匹林對SW1990細胞AKT的活性情況,發(fā)現(xiàn)阿司匹林單獨或者合用吉西他濱能明顯增加AKT蛋白437位絲氨酸的磷酸化水平,而單用吉西他濱對磷酸化AKT水平無明顯影響。同時,阿司匹林單獨或者合用吉西他濱能提高AKT的上游激酶PI3K的磷酸化水平。蛋白免疫印跡的圖片和灰度掃描見圖4A。

2.4 抑制PI3K/AKT通路使細胞恢復對吉西他濱的敏感性用PI3K/AKT通路的抑制劑LY294002預處理SW1990細胞30 min,能明顯逆轉阿司匹林引起的SW1990細胞對吉西他濱的耐受作用 ,細胞的凋亡率回升到50%,較未經(jīng)LY294002處理時明顯增加(P＜0.01),見圖4B。

圖3 經(jīng)不同藥物處理后凋亡細胞的百分率

圖4 藥物對細胞PI3K/AKT通路的影響

3 討 論

眾所周知,胰腺癌預后很差,中位生存期僅為3～6個月[5-6]。初診時,2/3的患者已失去手術治療機會;對傳統(tǒng)化療藥物和放療均耐受。吉西他濱問世后,用于胰腺癌治療,不僅改善了有效率,而且還顯著提高了胰腺癌患者的生活質量。但是就算以此藥治療,在臨床上患者的有效率也還是低于10%[7-8],這與胰腺癌廣泛的耐藥特性有關。胰腺癌耐藥有些是細胞本來具備的特性,有些是獲得性耐藥。所以在胰腺癌內(nèi)科治療方面,有必要對這一重要的藥物進行深入研究,探討其與其他藥物合用時是否產(chǎn)生耐藥及其機制。

阿司匹林自從1897年開始應用于臨床,至今已有過百年的使用歷史[9-10]。雖然有研究提示阿司匹林能促進癌細胞凋亡而抑制胰腺癌細胞存活以及在動物模型上成瘤,然而不少報道顯示阿司匹林能使結腸癌細胞免受去血清培養(yǎng)或者抗癌藥物處理引起的凋亡[5,11]。所以,研究阿司匹林在胰腺癌的治療中是否引起吉西他濱耐藥是非常必要的。

本研究應用人源的胰腺癌細胞株探討了臨床常用的非甾體抗炎藥阿司匹林對胰腺癌一線藥物吉西他濱的治療作用的影響。本研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林能明顯引起胰腺癌細胞對吉西他濱的耐受作用,主要表現(xiàn)在存活率抑制幅度的減少以及凋亡細胞的減少。以上阿司匹林的作用是由激活細胞促存活通路PI3K/AKT而引起的。本研究對臨床治療胰腺癌時合用藥物具有提示意義,也為進一步研究吉西他濱耐藥機制提供了有效的依據(jù)。

本研究中先用M TT法檢測到阿司匹林使吉西他濱對胰腺癌細胞的生存抑制率降低,而且通過核形態(tài)染色發(fā)現(xiàn)阿司匹林減少了吉西他濱引起的細胞凋亡,說明阿司匹林能引起胰腺癌細胞株SW1990對吉西他濱耐藥。阿司匹林引起耐藥的主要機制可能是PI3K/AKT通路的激活。因為PI3K/AKT是著名的細胞內(nèi)促存活途徑[12],是多種細胞產(chǎn)生耐藥的主要分子,且阿司匹林在保護結腸癌細胞免受去血清培養(yǎng)或者抗癌藥物處理引起的凋亡的過程中起著主導作用[5]。本研究用蛋白免疫印跡的方法檢測到阿司匹林能明顯活化PI3K和AKT激酶,而且,此通路的特異性抑制劑LY294002的應用能消除阿司匹林在胰腺癌細胞上抑制凋亡的作用,進一步表明PI3K/AKT通路是阿司匹林發(fā)揮作用的主要分子機制。

綜上所述,阿司匹林能引起胰腺癌細胞SW1990產(chǎn)生對吉西他濱的耐藥,此發(fā)現(xiàn)對臨床合理用藥有非常重要的指導作用。為此,需要在其他人胰腺癌細胞株上實驗并在動物實驗上得到驗證,以明確阿司匹林對吉西他濱臨床用藥的影響。

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