胡宏波,賈安平,劉振鵬,鄭 玲,梁秀蘭,馮 金,詹前美

(廣西壯族自治區(qū)柳州市柳鐵中心醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.消化內(nèi)科,廣西柳州545007)

脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad,FHIT)基因是抑癌基因,位于人類染色體3p14.2上,其cDNA由 10個(gè)外顯子組成,外顯子5～9組成一長約500 bp的開放性閱讀框,編碼一個(gè)由147個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量為16.8 kd的蛋白質(zhì)。該基因表達(dá)蛋白參與一系列的細(xì)胞進(jìn)程,包括對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和微管活動(dòng)的調(diào)節(jié)以及二腺苷三磷酸(AP3A)的水解等[1]。該基因內(nèi)含F(xiàn)RA3B脆性位點(diǎn),易斷裂,斷裂后使該基因失活,引起細(xì)胞異常增生,最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本研究對(duì)胃癌FHIT基因遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變進(jìn)行檢測(cè),探討FHIT基因的異常改變?cè)谖赴┑陌l(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2006年1月至2009年10月本院腔鏡中心胃鏡檢查并經(jīng)病理證實(shí)為胃癌的患者74例,男46例,女28例,年齡36～87歲,平均58.5歲;所有患者均取病變組織和正常胃黏膜組織各一份,樣本離體后30 min內(nèi)均迅速放置于-80℃冰箱中。臨床病理學(xué)分期采用國際抗癌聯(lián)盟1997修訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn),其中Ⅰ期 19例,Ⅱ期13例,Ⅲ期 22例,Ⅳ期20例。Lauren分型:腸型28例,彌漫型33例,混合型13例。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 參照大連TaKaRa公司試劑盒說明書進(jìn)行,提取產(chǎn)物用美國Bio-Rad公司SmartSpec plus核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA的濃度和純度,如OD260/OD280在1.6～1.8則置于-20℃的冰箱備用。

1.2.2 FHIT基因微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)和雜合性缺失(LOH)分析 利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增微衛(wèi)星標(biāo)記D3S1300,D3S1300引物和擴(kuò)增參數(shù)見表1。PCR反應(yīng)體系的構(gòu)成:Taq酶 0.5 μ L,模板 DNA 2.5 ng,上游引物(20 μ mol/L)1 μ L,下游引 物(20 μ mol/L)1 μ L,GC Buffer I 25 uL,dNTP(含Mg2+)8μL,滅菌蒸餾水加至 50 μ L。PCR產(chǎn)物行3%瓊脂糖電泳(80 V,120 min),結(jié)果經(jīng)美國Bio-Rad公司Gel DocTMXR凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)采用美國Bio-Rad公司Mini P-4垂直凝膠電泳系統(tǒng)。配制8%聚丙烯酰胺凝膠:30%的丙烯酰胺4 mL、5×TBE 3 mL 、10%過硫酸胺 0.11 mL、T EMED 10 μ L,加ddH2O至總體積15 mL。灌膠并插好梳子,待膠凝固移去樣品梳后,加入1×TBE于上下兩電泳槽內(nèi),用1×TBE沖洗加樣孔,樣品點(diǎn)樣(10 μ L 擴(kuò)增產(chǎn)物與 2 μ L 6×DNA Loading Buffer混合),60 V電壓進(jìn)行電泳,觀察溴酚藍(lán)完全泳出凝膠時(shí)結(jié)束。將凝膠小心剝?nèi)?.5μ g/mL EB溶液中,室溫染色30 min,用ddH2O沖洗凝膠 2次,將凝膠移至 Bio-Rad凝膠成像儀下照相,保存。結(jié)果判斷:選擇基因組DNA等位片段表現(xiàn)為雜合子者進(jìn)行LOH分析,純合子則為無信息個(gè)體。與正常胃黏膜組織相比,癌組織PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)等位基因條帶的增多或位置的移動(dòng)判定為 MSI,條帶消失或相對(duì)密度減少50%以上判定為LOH。

表1 FHIT基因引物和擴(kuò)增參數(shù)

表2 FHIT基因MSI和LOH及甲基化修飾與胃癌臨床指標(biāo)的關(guān)系

1.2.3 甲基化特異性PCR(MSP-PCR)甲基化修飾參照美國Epigentek公司產(chǎn)品說明書進(jìn)行;將已修飾的DNA分別用甲基化特異性引物和非甲基化特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。FHIT基因引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[2],引物和擴(kuò)增參數(shù)見表1。PCR反應(yīng)體系構(gòu)成、產(chǎn)物電泳及成像同1.2.2。將經(jīng)電泳鑒定存在單一明亮目的條帶的未純化PCR產(chǎn)物各取 50 μ L,即FHIT-M和FHIT-U為引物的PCR產(chǎn)物各1管,送廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或者Fisher精確檢驗(yàn),相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FHIT基因MSI和 LOH 74例胃癌患者中,59例為提供信息的雜合子個(gè)體,其中MSI有14例,占 23.7%;LOH的有17例,占 28.8%,二者總和為 31例,占 52.5%(圖 1)。FHIT基因MSI和LOH均與胃癌患者年齡、性別、Lauren分型、Borrmann分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及 TNM 分期無關(guān)(P＞0.05),但 LOH與浸潤程度存在正相關(guān)(P＜0.05),見表2。

2.2 FHIT基因的甲基化特異性 PCR(MSP)擴(kuò)增結(jié)果 FHIT基因行MSP擴(kuò)增后,產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到約79 bp特征性片段,與預(yù)期的FHIT-M和FHIT-U為引物的目的片段大小相符,見圖2。

2.3 FHIT基因的MSP擴(kuò)增后的測(cè)序結(jié)果 甲基化片段所有CpG位點(diǎn)保持不變,非甲基化片段所有C變成T。兩結(jié)果對(duì)比證實(shí),有CpG二核苷酸存在于序列中則為甲基化的CpG,而在對(duì)應(yīng)位置為TpG則為非甲基化的CpG。

2.4 FHIT基因甲基化狀態(tài) 正常胃黏膜組織均為FHIT基因非甲基化,74例胃癌組織中FHIT基因甲基化陽性為38例,檢出率為51.4%,其中完全甲基化9例。FHIT基因甲基化率在正常胃黏膜組織和胃癌組織中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。FHIT基因甲基化與胃癌患者年齡、性別、Lauren分型、Borrmann分型、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期無關(guān)(P＞0.05),見表2。

圖1 D3S1300位點(diǎn)MSI和 LOH

圖2 胃癌組織FHIT基因的MSP分析

2.5 胃癌FHIT基因甲基化與MSI和LOH之間的關(guān)系 59例雜合子中共有27例發(fā)生甲基化,27例甲基化樣品中8例MSI和9例 LOH,32例未甲基化樣品中 6例 MSI和 7例LOH,甲基化與MSI和LOH均不存在明顯相關(guān)性(P＞0.05,r=0.12和0.13)。

3 討 論

DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(M MR)是指存在人類細(xì)胞中的一種修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配的保障體系,其主要功能是修復(fù)DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生的單堿基錯(cuò)配和2個(gè)以上的插入/缺失(IDLs)錯(cuò)配。當(dāng)MM R出現(xiàn)不穩(wěn)定性變化或功能缺陷時(shí),與其連鎖或相關(guān)的微衛(wèi)星位點(diǎn)易發(fā)生MSI導(dǎo)致DNA序列的微妙變化和(或)LOH導(dǎo)致的染色體不穩(wěn)定性,在胃癌組織中存在高頻率的MSI和LOH,FHIT基因所在的染色體3p14.2區(qū)域的遺傳改變頻繁表達(dá)于胃癌和其他腫瘤[3]。有研究表明,FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島異常甲基化可導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)沉默(epigenetic silencing),也是其主要失活方式之一,從而直接參與胃癌的發(fā)生[4]。

微衛(wèi)星是具有高度多態(tài)性的短串聯(lián)重復(fù)核苷酸序列,與同一個(gè)體正常組織相比,MSI是指在腫瘤組織基因組中微衛(wèi)星簡單重復(fù)序列的增加或丟失;LOH則是腫瘤組織的某個(gè)等位基因消失。有研究表明,抑癌基因MSI與LOH在腫瘤的多步驟發(fā)生過程中起著重要的作用[5]。作為FHIT基因的分子標(biāo)志,微衛(wèi)星標(biāo)記D3S1300被認(rèn)為是檢測(cè)FHIT基因M SI和LOH的候選位點(diǎn)。Huiping等[6]的研究顯示,FHIT基因該位點(diǎn)MSI發(fā)生率為27.1%(13/48);Lee等[7]報(bào)道FHIT基因該位點(diǎn)LOH發(fā)生率為21.2%(7/33);肖玉平等[8]檢測(cè)了38例胃癌組織FHIT基因表達(dá),結(jié)果在D3S1300位點(diǎn)MSI發(fā)生率為36.8%(14/38),LOH發(fā)生率為26.3%(10/38)。本研究顯示,59例胃癌在 D3S1300位點(diǎn)的MSI發(fā)生率 23.7%(14/59),LOH發(fā)生率為28.8%(17/59),MSI發(fā)生率與肖玉平等的研究結(jié)果有一定差異,但其LOH發(fā)生率與及其他學(xué)者的研究結(jié)果較為接近。有學(xué)者對(duì)胃癌發(fā)生機(jī)制的研究時(shí)提出MSI和LOH是胃癌發(fā)生早期事件[9-10];Castagnaro等[11]對(duì)FHIT基因與腫瘤的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn),FHII基因MSI多發(fā)生在預(yù)后較好的臨床早期癌組織中,并認(rèn)為MSI可作為早期分子診斷的標(biāo)志。本文對(duì)FHIT基因的研究結(jié)果顯示,MSI和LOH與胃癌患者年齡、性別、Lauren分型、Borrmann分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期無關(guān),亦提示FHIT基因MSI可能用于胃癌的早期診斷;但隨著胃癌逐漸向胃壁深部的浸潤,FHIT基因LOH發(fā)生率增加,提示D3S1300位點(diǎn) LOH多發(fā)生于胃癌晚期,并有促進(jìn)浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的作用。因此,FHIT基因LOH檢測(cè)可作為胃癌惡性程度、轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。

由FHIT基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的表達(dá)靜默被認(rèn)為是引起胃癌發(fā)生的分子機(jī)制之一,并且已經(jīng)在胃癌組織中得到了證實(shí)[4]。本研究的MSP結(jié)果顯示,FHIT基因在正常胃黏膜組織均未出現(xiàn)甲基化陽性片段,但在74例胃癌組織中有38例發(fā)生甲基化,甲基化率為 51.4%,與 Leal等[12]的研究結(jié)果53.9%比較接近,但與文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道的FHIT基因62%和40%有一定差異,其原因可能與患者的遺傳背景和實(shí)驗(yàn)方法的差異有關(guān)。甲基化與胃癌患者年齡、性別、Lauren分型、Borrmann分型、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM 分期無關(guān),提示FHIT基因甲基化可能是胃癌發(fā)生的早期事件。本研究還對(duì)胃癌FHIT基因甲基化和MSI及LOH進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示甲基化與后兩者之間均無明顯相關(guān)性,提示甲基化與后兩者可能是通過不同的途徑對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展起作用,而相互之間并無明顯影響。

總之,FHIT基因失活機(jī)制除了以上三個(gè)方面,還可能涉及其他方面:染色體不穩(wěn)定、基因轉(zhuǎn)錄異常致蛋白表達(dá)降低或缺失、純合缺失、基因突變、表觀遺傳學(xué)的其他改變(如組蛋白乙?；?等,FHIT基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)過程中的變化勢(shì)必引起其功能的改變。因此進(jìn)一步研究FHIT基因在胃癌組織中的其他變化,對(duì)確定FHIT基因與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系有著重要的意義。

[1]Pecherzewska R,Nawrot B.FHIT-tumor suppressor protein involved in induction of apoptosis and cell cycle regulation[J].Postepy Biochem,2009,55(1):66.

[2]Z?chbauer-Müller S,Fong KM,Maitra A,et al.5′CpG Island Methylation of the FHIT Gene Is Correlated with Loss of Gene Expression in Lung and Breast Cancer[J].Cancer Res,2001,61:3581.

[3]張生軍,張才全.FHIT基因結(jié)構(gòu)、功能及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2004,33(9):1411.

[4]Leal MF,Lima EM,Silva PN,et al.Promoter hypermethylation of CDH1,FHIT,M TAP and PLAGL1 in gastric adenocarcinoma in individuals from Northern Brazil[J].World J Gastroenterol,2007,13(18):2568.

[5]Fukushima T,Takenoshita S.Colorectal carcinogenesis[J].Fukushima J Med Sci,2001,47(1):1.

[6]Huiping C,Kristjansdottir S,Bergthorsson JT,et al.High frequency ofLOH,MSI and abnormal expression of FHIT in gastric cancer[J].Eur J Cancer,2002,38(5):728.

[7]Lee SH,Kim WH,Kim HK,et al.Altered expression of the fragile histidine triad gene in primary gastric adenocarcinomas[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,284(3):850.

[8]肖玉平,韓埩波,李錦毅,等.胃癌FHIT基因雜合性缺失及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,35(2):122.

[9]Lee CL,Hsieh KS,Chen YL,et al.Identification of candidate genes for congenital ventricular septal defects with HSA22q11 loss of heterozygosity[J].Rev Esp Cardiol,2009,62(3):263.

[10]Perez RO,Jacob CE,D′Ottaviano FL,et al.Microsatellite instability in solitary and sporadic gastric cancer[J].Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo,2004,59(5):279.

[11]Castagnaro A,Marangio E,Verduri A,et al.Microsatellite analysis of induced sputum DNA in patients with lung cancer in heavy smokers and in healthy subjects[J].Exp Lung Res,2007,33(6):289.

[12]Leal MF,Lima EM,Silva PN,et al.Promoter hypermethylation of CDH1,FHIT,M TAP and PLAGL1 in gastric adenocarcinoma in individuals from Northern Brazil[J].World J Gastroenterol,2007,13(18):2568.

[13]Roa JC,Anabaló n L,Roa I,et al.Promoter methylation profile in gastric cancer[J].Rev Med Chil,2005,133(8):874.

[14]戴觀榮,景洪標(biāo),鄧鑒文,等.FHIT基因在胃癌中的異常甲基化及其表達(dá)[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,26(11):1304.