馮紅超,彭江帆,馬 洪,宋宇峰

(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系口腔頜面外科教研室,貴陽(yáng)550004)

腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的單核/巨噬細(xì)胞被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM),其功能狀態(tài)的研究對(duì)腫瘤的免疫治療具有重要的意義。由于單核/巨噬細(xì)胞不同的表型特征和活化特性與所處的局部微環(huán)境有關(guān),而腫瘤組織內(nèi)局部多處于缺氧狀態(tài),本文通過細(xì)胞培養(yǎng)的方法進(jìn)行研究,探討口腔癌中缺氧的微環(huán)境對(duì)單核/巨噬細(xì)胞功能影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于上海西唐生物科技有限公司;雙抗、淋巴細(xì)胞分離液、單核細(xì)胞分離液,購(gòu)于天津市灝陽(yáng)生物制品科技有限責(zé)任公司;抗CD68單克隆抗體、無鈣鎂PBS液購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 細(xì)胞 Tca-8113人舌鱗癌細(xì)胞株,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.3 單核/巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及獲取 采用密度梯度離心法后通過兩次貼壁法,獲得有大量單個(gè)核細(xì)胞貼壁的培養(yǎng)板,然后在培養(yǎng)板中加入 RPMI-1640(含10%胎牛血清、1%雙抗)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每隔3 d換液,到第7天時(shí)采用機(jī)械法收獲貼壁的單核/巨噬細(xì)胞。用倒置顯微鏡觀察,可見單核/巨噬細(xì)胞貼壁細(xì)胞逐漸變大,且胞體拉長(zhǎng),呈梭形或多角形,具備典型的單核/巨噬細(xì)胞形態(tài)。

1.4 流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定 用抗CD68單克隆抗體分析懸液中的細(xì)胞,單核/巨噬細(xì)胞定義為CD68陽(yáng)性細(xì)胞,結(jié)果CD68陽(yáng)性細(xì)胞占94.03%,滿足實(shí)驗(yàn)需要。以瑞氏染色計(jì)數(shù)單核/巨噬細(xì)胞數(shù)目,胎盤藍(lán)染色計(jì)數(shù)死細(xì)胞,中性紅計(jì)數(shù)活細(xì)胞,結(jié)果細(xì)胞活性大于96%。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)方法及檢測(cè) 將Tca-8113培養(yǎng)上清液(每孔0.3 mL)、巨噬細(xì)胞(每孔0.3 mL)加入12孔板中,缺氧組放入密閉的厭氧罐中(37℃、O2＜1%),常氧組在 37℃、20%O2、5%CO2條件下培養(yǎng),分別在3、5、7 h收集培養(yǎng)上清液,后采用人VEGF ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè),操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,采用配對(duì)t檢驗(yàn)及方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

缺氧微環(huán)境對(duì)單核/巨噬細(xì)胞分泌VEGF的影響(圖1)。在缺氧組培養(yǎng)5 h后,培養(yǎng)液中的VEGF顯著增高,7 h達(dá)到最高,在3、5、7 h,VEGF分泌量均高于同一時(shí)間內(nèi)的常氧培養(yǎng)條件下的分泌量,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),這說明缺氧條件下增加了單核/巨噬細(xì)胞分泌VEGF的能力。

圖1 缺氧微環(huán)境對(duì)單核/巨噬細(xì)胞分泌VEGF的影響

3 討 論

本研究顯示,在缺氧環(huán)境下單核/巨噬細(xì)胞分泌VEGF的能力增加。

腫瘤細(xì)胞必須依賴于宿主的支持才能夠形成腫瘤,包括各種組織細(xì)胞、炎細(xì)胞、淋巴管、維持腫瘤生長(zhǎng)和作為日后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移途徑的血管等,其共同構(gòu)成了腫瘤發(fā)生、發(fā)展的微環(huán)境[1]。有研究表明,巨噬細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)中細(xì)胞數(shù)量最多的一種[2]。單核/巨噬細(xì)胞具有廣泛生物學(xué)活性和高度復(fù)雜多變的表型,在腫瘤組織中,作為正向調(diào)控的效應(yīng)細(xì)胞,其介導(dǎo)直接的抗腫瘤細(xì)胞毒性或參與腫瘤相關(guān)抗原的提呈,以利于腫瘤的清除;另一方面,在腫瘤細(xì)胞組織內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞可分化形成具有獨(dú)特表型的巨噬細(xì)胞,這些巨噬細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及抑制T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)的抗腫瘤活性[3-4]。單核/巨噬細(xì)胞的功能取決于所處的微環(huán)境[5],針對(duì)不同的微環(huán)境信號(hào)行使不同的功能是巨噬細(xì)胞的生物學(xué)特征。而在實(shí)體腫瘤形成過程中,腫瘤生長(zhǎng)迅速,隨著腫瘤體積的增大,腫瘤內(nèi)部不能得到足夠的血液供應(yīng),導(dǎo)致供氧和耗氧的不平衡,許多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)部都存在一定程度或一定區(qū)域的缺氧,缺氧是大多數(shù)實(shí)體瘤的特征之一。本課題組的前期研究顯示,在口腔鱗癌組織內(nèi)有大量的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn),進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)口腔癌組織內(nèi)可以分泌對(duì)單核/巨噬細(xì)胞有趨化作用的血管細(xì)胞黏附分子-1[6],從而促使單核/巨噬細(xì)胞在口腔癌中的浸潤(rùn)和聚集。近年來越來越多的證據(jù)表明腫瘤組織中的單核/巨噬細(xì)胞通過多種途徑參與了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7-8],本課題組在口腔癌的研究中發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細(xì)胞可以分泌促腫瘤血管生成作用最強(qiáng)的因子之一VEGF[9],而VEGF在口腔癌生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用[10]?？谇话┘捌渌[瘤的研究中表明腫瘤組織中浸潤(rùn)的單核/巨噬細(xì)胞多聚集在微血管較少的缺氧區(qū)域[11-12]。因此本研究推測(cè)可能由于局部缺氧的微環(huán)境是促使單核/巨噬細(xì)胞的功能發(fā)生了改變,而本研究進(jìn)一步證實(shí)在局部缺氧的微環(huán)境下,單核/巨噬細(xì)胞分泌VEGF的能力增加,從而更多地參與了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

總之,本研究表明在缺氧的微環(huán)境下,單核/巨噬細(xì)胞可能通過分泌功能更多的參與了腫瘤的生長(zhǎng),但由于單核/巨噬細(xì)胞又具有復(fù)雜表型和活化狀態(tài),因此其在腫瘤中的具體機(jī)制及如何調(diào)節(jié)其功能均需要進(jìn)一步的研究。

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