周婭紅

安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(合肥230031)

人參是傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，具有補(bǔ)氣生血、扶正祛邪等功效。人參總皂苷(Saponins of panax ginseng，SPG)是人參主要的有效成分之一，研究證實(shí)其具有良好的抗病毒、抗衰老、抗氧化等作用［1-3］。本文通過對(duì)復(fù)制免疫低下小鼠模型，探討人參皂苷的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料藥物:SPG，安徽省宣城百草植物工貿(mào)有限公司;參芪片，吉林制藥股份有限公司。動(dòng)物:昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄兼用;ICR小鼠，體質(zhì)量(18±2)g，雌雄兼用。均由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字02號(hào)。試劑:注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司;印度墨汁，北京西中化工廠;二硝基氟苯，上海試劑一廠。儀器:分光光度計(jì)722S，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;800B低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 人參皂苷對(duì)免疫低下小鼠非特異性免疫功能的影響將昆明種小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、SPG低劑量組(60mg/kg)、SPG中劑量組(120mg/kg)、SPG高劑量組(240mg/kg)及陽性藥物組(540mg/kg)，每組10只。SPG各組灌胃相應(yīng)劑量的SPG溶液，陽性藥物組灌胃參芪片溶液，每日1次，連續(xù)7d。除正常組外，第3日開始各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg，每日1次，連續(xù)2d。第7日所有小鼠尾靜脈注入離心后的50%印度墨汁(0.01mL/g)，2min和10min后分別摘除眼球取血40μL，并將其加到4mL 0.1%NaHCO3溶液中，在600nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值(A)，以正常小鼠血加Na2CO3溶液作空白對(duì)照。稱量小鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼處死小鼠，分離肝臟、脾臟并稱濕質(zhì)量，按下列公式計(jì)算:碳廓清指數(shù)(K)=(lgA1-lgA2)/(T2-T1);吞噬指數(shù)(α)=

1.3 SPG對(duì)免疫低下小鼠免疫器官質(zhì)量的影響記錄小鼠體質(zhì)量，頸椎脫臼處死小鼠，取脾、胸腺并稱濕質(zhì)量，以小鼠脾質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/10g)和胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/10g)作為脾臟和胸腺指數(shù)。

1.4 SPG對(duì)免疫低下小鼠體液免疫功能的影響

1.4.1 血清IgM溶血素的測(cè)定 取昆明種小鼠，分組及給藥方法同“1.2”項(xiàng)。第3日所有小鼠腹腔注射10%SRBC 0.2mL致敏。除正常組外，其余各組同時(shí)腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg，連續(xù)2d，制備免疫低下模型。致敏后第5日，摘除眼球取血，收集血清并進(jìn)行800倍稀釋，吸取0.5mL稀釋血清放入另一試管中，依次加入10%SRBC、補(bǔ)體、生理鹽水各0.5mL，空白管用生理鹽水代替血清。上述試管置37℃溫箱溫育1h，離心5min，取上清液，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.4.2 血清IgG溶血素的測(cè)定 分組、給藥及致敏方法“1.4.1”項(xiàng)，第1次致敏后5d，用同劑量二硝基氟苯再次致敏小鼠，再次免疫后8d摘除眼球取血。血清加等量2-巰基乙醇，于37℃水浴保溫0.5h，隨后將血清800倍稀釋。取2-巰基乙醇處理后的血清0.5mL和5%SRBC 0.5mL，充分混勻，再加羊抗小鼠IgG和補(bǔ)體各0.5mL，空白管以0.5mL生理鹽代替血清。上述試管置37℃溫箱溫育1h，離心，取上清液，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.5 遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)取ICR小鼠，分組方法同“1.2”項(xiàng)。各組灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)9d。第3日除抗原攻擊的正常組外，每只小鼠腹部涂1%二硝基氟苯丙酮麻油溶液50μL致敏(范圍3cm×3cm)。次日同劑量強(qiáng)化1次，除正常組外，各組同時(shí)腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg，每日1次，連續(xù)2d，制備免疫低下模型。致敏5d后，將1%二硝基氟苯溶液均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進(jìn)行攻擊，對(duì)照組同樣涂耳但未致敏。攻擊24h，頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用直徑9mm的打孔器打下圓耳片，稱質(zhì)量。以左右耳片之差為腫脹度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以(x±s)表示，各組均數(shù)之間比較進(jìn)行one-way ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷對(duì)免疫低下小鼠非特異性免疫功能的影響見表1。與正常組相比，模型組小鼠碳廓清指數(shù)(K)和吞噬指數(shù)(α)明顯降低(P＜0.01);與模型組相比，SPG中、高劑量組及陽性藥物組可顯著提高小鼠碳廓清指數(shù)(K)和吞噬指數(shù)(α)(P＜0.05或0.01)，SPG低、中、高劑量組與陽性藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);SPG低、中、高劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中以SPG高劑量組的作用最為明顯。

表1 各組非特異性免疫功能比較 (±s)

表1 各組非特異性免疫功能比較 (±s)

與模型組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01;與正常組比較，△P＜0.05;與陽性藥物組比較，#P＜0.05。下同

組 別n K(10-2)α正常組104.20±0.776.00±0.63模型組102.46±0.84△4.51±0.92△SPG低劑量組102.97±0.735.07±0.57 SPG中劑量組103.22±0.58＊5.36±0.62＊SPG高劑量組103.35±0.66＊＊5.41±1.01＊陽性藥物組103.54±0.87＊＊5.38±0.94＊

2.2 SPG對(duì)免疫低下小鼠免疫器官質(zhì)量的影響見表2。與正常組相比，模型組小鼠脾臟器指數(shù)和胸腺臟器指數(shù)顯著降低(P＜0.01);與模型組相比，SPG中、高劑量組及陽性藥物組可顯著提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)(P＜0.05或0.01)，SPG低、中、高劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，其中以SPG高劑量組的作用最為明顯。

表2 各組免疫器官指數(shù)比較 (mg/g，±s)

表2 各組免疫器官指數(shù)比較 (mg/g，±s)

組 別n脾臟指數(shù) 胸腺指數(shù)正常組104.80±1.024.69±0.99模型組102.66±0.59△2.30±0.43△SPG低劑量組103.14±0.922.79±0.95 SPG中劑量組103.49±0.71＊3.01±0.53＊SPG高劑量組103.82±0.71＊＊3.04±0.61＊陽性藥物組103.83±0.88＊＊2.99±0.51＊??

2.3 SPG對(duì)免疫低下小鼠體液免疫功能的影響見表3。與正常組相比，模型組小鼠HCIgM、HCIgG水平顯著降低(P＜0.01);與模型組相比，SPG低、中、高劑量組及陽性藥組可顯著提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠HCIgM、HCIgG水平 (P＜0.05或0.01)，SPG低、中、高劑量組與陽性藥物組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);人參皂苷低、中、高劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其中以人參皂苷高劑量組的作用最為明顯。

表3 各組體液免疫功能及耳腫脹度比較 (±s)

表3 各組體液免疫功能及耳腫脹度比較 (±s)

組 別正常組模型組SPG低劑量組SPG劑量組SPG高劑量組陽性藥物組n 10 10 10 10 10 10 HCIgM 55.47±19.56 28.64±3.40△37.94±8.00＊38.14±6.51＊39.62±5.89＊39.28±4.90＊HCIgG 39.32±8.70 27.62±3.94△34.08±6.87＊34.33±5.10＊34.91±6.30＊35.75±6.21＊耳腫脹度3.59±0.49 1.99±0.45△2.46±0.60#2.70±0.63＊3.08±0.65＊＊3.15±0.52＊＊

2.4 SPG對(duì)小鼠DTH反應(yīng)的影響見表3。與正常組相比，模型組小鼠耳腫脹程度明顯降低(P＜0.01);與模型組相比，SPG中、高劑量組及陽性藥物組可使小鼠耳片腫脹度顯著增加(P＜0.05或0.01)，SPG低、中、高劑量組與陽性藥物組比較，SPG中、高劑量組無差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SPG低劑量組作用效果明顯低于陽性藥物組(P＜0.05);SPG低、高劑量組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示SPG高劑量組作用效果最為明顯。

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種烷化類的免疫抑制劑，可殺傷淋巴細(xì)胞，抑制免疫反應(yīng)。環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠是研究藥物免疫調(diào)節(jié)作用的經(jīng)典動(dòng)物模型［4］。機(jī)體免疫系統(tǒng)由非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫共同構(gòu)成的防御系統(tǒng)。脾臟及胸腺是機(jī)體的兩個(gè)主要免疫器官，是機(jī)體防御機(jī)能發(fā)揮的重要環(huán)節(jié)，其臟器指數(shù)是衡量機(jī)體免疫功能的初步指標(biāo)［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPG低、中、高劑量組之間，各劑量組與陽性藥物之間作用強(qiáng)度差異雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但SPG中、高劑量組可提高免疫低下小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，提示中、高劑量的SPG能夠?qū)C(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能起到很好的保護(hù)。

小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)中所測(cè)得的廓清指數(shù)(K)可反映網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，吞噬指數(shù)(α)則反映單核-巨噬細(xì)胞的吞噬能力。而單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能是衡量機(jī)體非特異性免疫功能的指標(biāo)之一［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPG各劑量組與陽性藥物之間作用強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但SPG中、高劑量組可顯著提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠碳廓清指數(shù)(K)值和吞噬指數(shù)(α值)，對(duì)免疫低下小鼠的非特異性免疫功能有促進(jìn)作用。

血清溶血素HCIgM、HCIgG可以代表抗體量，因此HCIgM、HCIgG的水平可以反映體液免疫功能［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPG低、中、高劑量組可提高明顯提高其低下的HCIgM、HCIgG水平，提示SPG對(duì)體液免疫有保護(hù)作用，且各劑量組之間、各劑量組與陽性藥物組之間作用強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

DTH是依賴細(xì)胞免疫的反應(yīng)，其實(shí)質(zhì)是變應(yīng)原引起的T細(xì)胞介導(dǎo)為主的炎癥反應(yīng)。變應(yīng)原使TH細(xì)胞活化，促使形成致敏的TD和TC細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體再次接觸相同變應(yīng)原時(shí)，TD細(xì)胞釋放出多種淋巴因子，導(dǎo)致反應(yīng)局部組織發(fā)生以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥反應(yīng)，與機(jī)體細(xì)胞免疫能力相一致［8］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SPG中、高劑量組可使小鼠耳片腫脹度顯著增加，且SPG低劑量組作用強(qiáng)度與人參皂苷中、高劑量組、陽性藥物組相比具有顯著差異，提示SPG中、高劑量組可以改善免疫低下小鼠DTH反應(yīng)，對(duì)小鼠特異性細(xì)胞免疫功能有促進(jìn)作用。

綜上所述，SPG對(duì)免疫低下小鼠非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫功能具有一定的促進(jìn)作用，以SPG高劑量作用最為顯著，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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