趙小艷,郝 斌 ,楊 濤,曹文東,皮興濤,續(xù)慧民

下肢深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis,DVT)是由手術(shù)、創(chuàng)傷、腫瘤等多種因素導(dǎo)致的血栓性疾病,其中20%不明原因深靜脈血栓形成患者合并抗磷脂綜合征(antiphospholipid syndrome,APS)[1]。APS是由于血清抗磷脂抗體(anti-phospholipidantibody,APL)滴度升高所導(dǎo)致的自身免疫性疾病,其特征為反復(fù)的動(dòng)靜脈血栓形成、習(xí)慣性流產(chǎn)、血小板減少等[2]。目前APL活化內(nèi)皮致血栓形成的確切機(jī)制尚不明確,可能與NF-κ B/Rel系統(tǒng)有關(guān)[3]。NF-κ B是多亞單位轉(zhuǎn)錄因子,可以與核內(nèi)某些基因的調(diào)控序列結(jié)合使其活化,引起細(xì)胞組織因子、黏附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶、趨化因子等表達(dá)明顯增加,內(nèi)皮細(xì)胞向促凝及促炎癥的表型轉(zhuǎn)變。炎癥標(biāo)志物基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metaloproteinase-9,MMP-9)又稱明膠酶 B,通過(guò)炎癥反應(yīng)促進(jìn)血栓形成[4]。MM P-9濃度在APS患者血清中顯著升高[5],那么 APS患者是否通過(guò) APL誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)增高促進(jìn)血栓形成是本研究的一個(gè)目的。

氟伐他汀,一種羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,除降脂外還有改善內(nèi)皮功能、抗炎、減少血栓形成等保護(hù)心血管作用[6]。氟伐地汀可獨(dú)立于降脂作用降低高膽固醇血癥患者血清MMP-9表達(dá)水平[7]。那么其是否可以通過(guò)降低APL誘導(dǎo)的M MP-9表達(dá)抑制血栓形成,這為臨床DVT合并APS的治療提供了新思路。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC-12購(gòu)自上海門諜塔生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 主要試劑 TRIZOL試劑為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品,RPMI1640培養(yǎng)基為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品,TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、transtaq酶為日本 TaKaRa公司產(chǎn)品,PCR引物由Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì),北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成,Western blot試劑盒為美國(guó)KPL公司產(chǎn)品,MM P-9ELISA試劑盒、兔抗人NF-κ Bp65多克隆抗體為武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品,氟伐他汀為北京諾華公司產(chǎn)品,胎牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液、37℃、5%CO2飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。

1.3.2 病例收集及血清制備 收集2009年1月—2009年7月山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管乳腺外科下肢DV T合并APS住院患者(均ACL＞40 U和/或抗β2GPI＞70 U 10例),同期體檢健康者10例。清晨空腹采血20 mL,留取血清保存于-70℃。

1.3.3 細(xì)胞分組 A組:空白對(duì)照組,未加任何干預(yù)因素培養(yǎng)基。B組:正常血清對(duì)照組,50%培養(yǎng)基+50%健康對(duì)照血清。C組:APS患者血清組,50%培養(yǎng)基+50%APS患者血清。D1組:50%APS患者血清+2.5 mol/L氟伐他汀組。D2組:50%APS患者血清+5 mol/L氟伐他汀組。D3組:50%APS患者血清+10 mol/L氟伐他汀組。E1組:50%APS患者血清+2.5 mol/L氟伐他汀+0.2 mmol/L甲羥戊酸組。E2組:50%APS患者血清+5 mol/L氟伐他汀+0.2 mmol/L甲羥戊酸組。E3組:50%APS患者血清+10 mol/L氟伐他汀+0.2 mmol/L甲羥戊酸組。

1.3.4 培養(yǎng)液中MMP-9濃度的檢測(cè) 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定MMP-9濃度。

1.3.5 RT-PCR檢測(cè)MMP-9mRNA表達(dá) Trizol試劑法提取各組細(xì)胞總RNA,采用RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis kitK1622反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.6 Western-blot檢測(cè)NF-κ B p65蛋白表達(dá) 通過(guò)凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,將NF-κ B p65及β-actin的蛋白條帶灰度的比值作為 NF-κ B p65的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-9濃度 A組和B組MMP-9濃度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。C組 MMP-9明顯升高(P＜0.05),D1、D2、D3組MMP-9濃度較C組下降(P＜0.05)。E組與C組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見圖1。

圖1 各組細(xì)胞培養(yǎng)液M MP-9濃度比較

2.2 RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞M MP-9mRNA表達(dá) 各組細(xì)胞均可以檢測(cè)到MMP-9mRNA表達(dá),于187bp處可見一條亮帶,半定量結(jié)果顯示:C組細(xì)胞MMP-9mRNA相對(duì)表達(dá)量高于A、B組(P＜0.05),D1 、D2、D3組細(xì)胞 MMP-9mRNA 相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性下降(P＜0.05),E組細(xì)胞 MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量與C組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表1。

表1 各組MMP-9mRNA表達(dá)水平比較(±s)

表1 各組MMP-9mRNA表達(dá)水平比較(±s)

組別 n MM P-9mRNA相對(duì)表達(dá)量A組 3 0.172±0.013 B組 3 0.166±0.012 C組 3 0.628±0.0241)D1組 3 0.469±0.0161)2)D2組 3 0.348±0.0161)2)D3組 3 0.278±0.0261)2)3)E1組 3 0.621±0.0332)E2組 3 0.614±0.0312)E3組 3 0.614±0.0342)與A組比較,1)P＜0.05;與C組比較,2)P＜0.05;與D1、D2組比較,3)P＜0.05

2.3 Western-blot法檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κ Bp65含量 A組、B組細(xì)胞NF-κ B p 6 5含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。C組細(xì)胞NF-κ Bp65表達(dá)明顯升高,D1、D2、D3組細(xì)胞 NF-κ Bp65表達(dá)較C組下降,并具有濃度依賴性(P＜0.05),E組細(xì)胞與C組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 各組NF-κ Bp65總蛋白表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組NF-κ Bp65總蛋白表達(dá)水平比較(±s)

組別 n NF-κ Bp65總蛋白表達(dá)量A組 3 1.017 2±0.002 9 B組 3 1.020 0±0.002 8 C組 3 1.165 9±0.007 71)D1組 3 1.066 0±0.004 51)2)D2組 3 1.051 2±0.009 41)2)D3組 3 1.033 6±0.009 01)2)3)E1組 3 1.158 6±0.006 92)E2組 3 1.155 6±0.008 02)E3組 3 1.155 1±0.006 72)與A組比較,1)P＜0.05;與C組比較,2)P＜0.05;與D1、D2組比較,3)P＜0.05

3 討 論

DVT合并APS的特征為難治而反復(fù)發(fā)生的血栓形成。APL在APS的病理過(guò)程中擔(dān)任著重要角色。APL通過(guò)與β2-糖蛋白-磷脂復(fù)合物結(jié)合活化內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥分子、細(xì)胞因子等表達(dá),從而導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成,這些作用可能與NF-κ B/Rel系統(tǒng)激活有關(guān)。NF-κ B是多亞單位轉(zhuǎn)錄因子,與核內(nèi)某些基因的調(diào)控序列結(jié)合使其活化,引起細(xì)胞組織因子、黏附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶等表達(dá)明顯增加,內(nèi)皮細(xì)胞向促凝及促炎癥的表型轉(zhuǎn)變。

MMPs是一個(gè)具有鋅結(jié)構(gòu)域的內(nèi)皮蛋白酶家族,不僅在正常組織的細(xì)胞外基質(zhì)重塑中起關(guān)鍵作用,而且在動(dòng)脈粥樣硬化,斑塊破裂,血栓形成等病理過(guò)程中也起一定作用。MMP-9為明膠酶B,其表達(dá)是一個(gè)在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白分泌水平復(fù)雜的體系,受細(xì)胞因子、炎癥、金屬蛋白酶類組織抑制劑的調(diào)節(jié)[5],尤其與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[4]。MM P-9濃度在自身免疫系統(tǒng)疾病[6]及動(dòng)脈粥樣硬化、冠脈綜合征、外周血管疾病[7]患者血清中顯著升高。本研究從mRNA及蛋白水平分別檢測(cè)了人血管內(nèi)皮細(xì)胞上 MMP-9及NF-κ Bp65的表達(dá),證實(shí)APS患者血清能明顯促進(jìn)人血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP-9及NF-κ Bp65的表達(dá),表明APS患者血栓形成可能是由APL通過(guò)NF-κ B途徑上調(diào)MM P-9表達(dá)所致。另有研究表明APL活化內(nèi)皮與內(nèi)皮表面toll-like樣受體介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[8]。

氟伐他汀通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制HMG-CoA還原酶,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的異戊二烯類含量減少,抑制 Iκ B激酶復(fù)合體磷酸化致Iκ B的降解減少,降低NF-κ B的活性,從而起心血管保護(hù)作用[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,氟伐他汀可減少巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)水平[10]。本研究從細(xì)胞水平也證實(shí)氟伐他汀劑量依賴性抑制APL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞MM P-9及 NF-κ Bp65的表達(dá),甲羥戊酸可抑制其作用。說(shuō)明其可能通過(guò)抑制NF-κ B途徑降低APL誘導(dǎo)的MM P-9表達(dá)抑制血栓形成。

臨床上針對(duì)DVT合并APS的治療主要包括抗凝、溶栓等,但是由于出血傾向、費(fèi)用昂貴等限制了其長(zhǎng)期使用,使得此類患者血栓反復(fù)發(fā)作,尋找新的預(yù)防用藥,迫在眉睫。本研究提示氟伐他汀可能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞MM P-9的表達(dá)干預(yù)APS誘導(dǎo)的血栓形成,為今后DVT合并APS的治療及預(yù)防提供了新的思路。

[1]Farmer-Boatwright MK,Roubey RA.Venous thrombosis in the antiphospholipid syndrome[J].Arterioscler T hromb Vasc Biol,2009,29(3):321-325.

[2]Lim W,Crowther M A,Eikelboom JW.Management of antiphospholipid antibody syndrome:A systematic review[J].JAMA,2006,295:1050-1057.

[3]Pieranqeli SS,Harris EN.Probing antiphospholipid-mediated thrombosis:The interplay between anticardiolipin antibodies and endothelial cells[J].Lupus,2003,12(7):539-545.

[4]付錦,張雪梅.基質(zhì)金屬蛋白酶-9與腦梗死的關(guān)系[J].中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2007,14(3):170-172.

[5]Faber-elmann A,Sthoeger Z,T chernlack A,et al.Activity of matrix metalloproteinase-9 is elevated in sera of patients with sy stemic lupus erythematosus[J].Clin Exp Immunol,2002,127:393-398.

[6]Ram M,Sherer Y,Shoenfeld Y.Metrix metalloproteinase-9 and autoimmune disease[J].Clin,Immunol,2006,26(4):299-307.

[7]Castillo J,Alvarez-Sabin J,Martinez-Vila E,et al.Inflammation markers and prediction of post-stroke vascular disease recurrence:The M ITICO study[J].Neurol,2009,256(2):217-224.

[8]Meroni P L,Raschi E,Testoni C,et al.Innate immunity in the antiphospholipid sy ndrome role of toll-like receptors in endothelial cell activation by antiphospholipid antibodyies[J].Autoimmun Rev,2004,9,510-515.

[9]渠莉,王津文.氟伐他汀類藥物的非調(diào)脂機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥,2006,1(6):379-381.

[10]Bellosta S,Via D,Canavesi M,etal.HMG-CoA reductase inhibitors reduce MMP-9 Secretion by macrophages[J].Arterioscler T hromb Vasc Biol,1998,18:1671-1678.