于曉偉,李春紅,張松靈,張曉霞,何 津,張麗宏,崔滿華

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,吉林 長(zhǎng)春130021;2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室,吉林 長(zhǎng)春130021;3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科,吉林 長(zhǎng)春130041)

PD-L1、PD-L2是新發(fā)現(xiàn)的B7家族共刺激分子配體,二者具有共同的受體PD-l,并通過與受體PD-1結(jié)合抑制T細(xì)胞的增殖和過度活化,在細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中起負(fù)調(diào)控作用,同時(shí)通過影響細(xì)胞因子的分泌對(duì)體液免疫也發(fā)揮了調(diào)控作用。PD-Ll、PDL2/PD-1路徑在機(jī)體自身免疫耐受和腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫監(jiān)控過程中都發(fā)揮著重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤表達(dá)PD-Ll。PD-L1在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)削弱其免疫原性,影響其產(chǎn)生特異性T細(xì)胞應(yīng)答,抑制腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PDLl能通過誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞的凋亡而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)組:卵巢癌癥患者40例,來源于2005年3月-2007年10月期間在吉林大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科的住院手術(shù)患者,年齡45-70歲,平均年齡(58.3±13.7)歲。卵巢癌患者術(shù)前均未行放療、化療。所有病例均經(jīng)手術(shù)病理確診為漿液性上皮性卵巢癌。

對(duì)照組:子宮肌瘤患者經(jīng)病理證實(shí)的正常卵巢組織10例,來源于同期在吉林大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科行子宮切除術(shù)及附件切除術(shù)的患者,年齡45-60歲,平均年齡(50.3±4.21)歲。

卵巢癌組織及正常卵巢組織標(biāo)本固定于10%的福爾馬林固定液中,經(jīng)取材、脫水、透明、浸蠟、包埋后,切片。切片厚為4 μ m,烤干后備用。

1.2 免疫組織化學(xué)法

1.2.1主要試劑及試劑盒 兔抗多克隆抗體PD-L1,濃縮型,購自于Santia公司,工作液為1∶100;

通用型SP試劑盒,及DAB顯色試劑盒購于福州邁新公司

1.2.2具體步驟 (1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水洗;(2)檸檬酸鹽95℃熱修復(fù)5 min后,室溫冷卻;(3)PBS洗5 min,洗3次;(4)阻斷劑(試劑A)去內(nèi)源性過氧化酶,室溫15min;(5)PBS洗5 min,洗3次;(6)加封閉液(試劑B)室溫封閉15 min;(7)滴加一抗,4℃過夜;(8)PBS洗5min,洗3次;(9)滴加生物素標(biāo)記的抗鼠/兔IgG的第二抗體(試劑C),室溫15 min;(10)PBS洗5 min,洗3次;(11)滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白(試劑D)室溫15 min;(12)PBS洗5 min,洗3次;(13)滴加顯色劑DAB,光鏡下觀察,顯色適當(dāng)后用水終止;(14)Mayer蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,水洗;(15)弱氨水返藍(lán),水洗;(16)脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.3結(jié)果判定 陽性結(jié)果:細(xì)胞胞漿或(和)胞膜呈棕黃色顆粒。在局部陽性染色區(qū)域內(nèi)評(píng)估PD-L1+癌細(xì)胞占所有癌細(xì)胞的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

正態(tài)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003的統(tǒng)計(jì)學(xué)工具進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果以s表示,經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后,組間比較采用 t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用SPSS10.0 for windows軟件包處理。

2 結(jié)果

PD-L1主要表達(dá)在卵巢癌上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)或(和)胞膜上(見圖1:a-b);而正常卵巢組織不表達(dá)PD-L1。在400×顯微鏡下分析PD-L1表達(dá)情況。在局部陽性染色區(qū)域內(nèi)評(píng)估PD-L1+癌細(xì)胞占所有癌細(xì)胞的比例。每400×視野至少200個(gè)癌細(xì)胞。癌細(xì)胞中PD-L1+癌細(xì)胞的平均比例51.2±11.0%,范圍12.1-80.1%。

3 討論

在免疫應(yīng)答的過程中,除了通過APC遞呈MHC處理過的抗原給抗原特異T細(xì)胞以提供第一信號(hào)外,還需共刺激分子作為輔助信號(hào)的協(xié)同作用,達(dá)到生理閾值后才能使T細(xì)胞活化,產(chǎn)生正常的應(yīng)答反應(yīng)。目前己知的共刺激分子分為3個(gè)家族,即免疫球蛋白超家族、TNF家族和細(xì)胞因子家族。其中免疫球蛋白超家族是唯一能從APC單向傳遞信號(hào)到T細(xì)胞的共刺激分子。PD-L1、PD-L2是新發(fā)現(xiàn)的B7家族共刺激分子配體,二者具有共同的受體PD-l,并通過與受體PD-1結(jié)合抑制T細(xì)胞的增殖和過度活化,在細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中起負(fù)調(diào)控作用,同時(shí)通過影響細(xì)胞因子的分泌對(duì)體液免疫也發(fā)揮了調(diào)控作用。PD-Ll、PD-L2/PD-1路徑在機(jī)體自身免疫耐受和腫瘤細(xì)胞逃逸機(jī)體免疫監(jiān)控過程中都發(fā)揮著重要作用。

圖1 卵巢癌上皮細(xì)胞PD-L1的表達(dá)

腫瘤表達(dá)的抗原能夠被宿主的T細(xì)胞識(shí)別,但是腫瘤的清除卻很少。這一失敗的原因部分歸于腫瘤微環(huán)境的免疫抑制的存在。例如腫瘤細(xì)胞分泌各種免疫抑制分子例如TGF-β和可溶性MHCI類鏈相關(guān)分子[1、2]表達(dá)免疫抑制性分子Fas配體[3],誘導(dǎo)T細(xì)胞表達(dá)CTLA-4[4]。

近年來發(fā)現(xiàn)免疫抑制性受體PD-1在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。PD-1表達(dá)在活性T細(xì)胞及B細(xì)胞上,通過募集酪氨酸磷酸酶SHP-2來抑制它們的活性。T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等表達(dá)PD-Ll[5]。在非淋巴組織有廣泛表達(dá),胸腺組織高表達(dá) PD-L1,心臟、脾、腎、肝、肺、皮膚、肌肉也有不同程度的中等表達(dá)。此外有報(bào)道胎盤也表達(dá)PD-LI。

表達(dá)在抗原提呈細(xì)胞上的PD-Ls通過作用于T細(xì)胞上的PD-1,誘導(dǎo)T細(xì)胞無能或凋亡,因此外周組織表達(dá)PD-Ls直接抑制自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞。近來研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤表達(dá)PD-Ll,包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等均有報(bào)道[6-14]。此外PD-1在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上調(diào),這可能誘導(dǎo)免疫抑制[109]。PD-L1表達(dá)于卵巢癌上皮內(nèi),而非間質(zhì)和浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞,提示PD-L1抑制腫瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞的移動(dòng)[15]。值得注意的是近來研究還發(fā)現(xiàn),表達(dá)PD-L1的腫瘤患者預(yù)后不好,例如腎癌、卵巢癌、膀胱癌,胃癌、乳腺癌和胰腺癌,此外這些研究提示腫瘤細(xì)胞高表達(dá)PD-L1的患者臨床分期晚,轉(zhuǎn)移早。

本研究中所有被檢測(cè)的卵巢癌患者腫瘤細(xì)胞的胞漿或(和)胞膜均表達(dá)PD-L1,癌細(xì)胞中PD-L1+癌細(xì)胞的平均比例51.2±11.0%,范圍12.1-80.1%。目前研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-Ll通過下列方面削弱機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答:(1)PD-L1在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)削弱其免疫原性,影響其產(chǎn)生特異性T細(xì)胞應(yīng)答,抑制腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。(2)腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-Ll能通過誘導(dǎo)特異性CTL的凋亡而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[16]。(3)腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞分泌的IL-10以及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF均可上調(diào)DC表面PD-L1的表達(dá),直接影響其激發(fā)T細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力。

與其他腫瘤相比,卵巢癌PD-L1表達(dá)要高于其他惡性腫瘤,例如肺癌(50%),食道癌(44%),胃癌(42%),腎癌(37%)等,說明PD-L1可能在卵巢癌的抑制宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Junzo研究發(fā)現(xiàn)接近50%卵巢癌患者表達(dá)PD-L2,與肺癌和食道癌相近。他還同時(shí)分析了PD-Ls與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)高表達(dá)PD-L1的患者與低表達(dá)或不表達(dá)PD-L1的患者相比預(yù)后差,而且PD-L1的表達(dá)與臨床病理分期和腫瘤的病理類型無相關(guān)性,和其他的預(yù)后指標(biāo)例如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及殘余病灶等相比PDL1的表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。在腎癌食道癌及胃癌研究中發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)也是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)[17-19]。但也有相反報(bào)道在肺癌中PD-Ls表達(dá)與預(yù)后的無相關(guān)性[20]。

在有關(guān)腫瘤細(xì)胞表達(dá)PD-Ls抑制CD8+T細(xì)胞功能的研究中,Junzo發(fā)現(xiàn)卵巢癌上皮內(nèi)CD8+TIL可以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。卵巢癌PD-L1的表達(dá)與卵巢癌上皮內(nèi)CD8+TIL的計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān),而PD-L2的表達(dá)與卵巢癌上皮內(nèi)CD8+TIL的計(jì)數(shù)無關(guān)。

腫瘤表達(dá)PD-L1誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸,導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng),提示PD-1/PD-L1途徑可以作為腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。實(shí)際上已有各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)阻斷PD-1或PD-L1,可以有效地清除腫瘤。

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