周 樂,張純海,畢麗榮,崔俊生,孫 輝*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院甲狀腺外科;吉林長(zhǎng)春130033;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院病理科,吉林長(zhǎng)春130033)

轉(zhuǎn)錄因子類癌基因STAT3的異常表達(dá)和激活在惡性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤組織與細(xì)胞系中已證實(shí)存在[1]。筆者率先報(bào)道了STAT3在甲狀腺癌組織中的表達(dá),但其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步闡釋。本實(shí)驗(yàn)研究甲狀腺癌組織中活化STAT3(pSTAT3)蛋白表達(dá)以及STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路成員(VEGF、Cyclin D1)的表達(dá),以期了解 STAT3基因在人甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的意義。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

24例甲狀腺標(biāo)本取自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院2007年7月-2007年12月手術(shù)切除組織,其中12例為甲狀腺癌組織,包括乳頭狀癌10例,濾泡癌1例,髓樣癌1例。另12例標(biāo)本為相應(yīng)癌組織旁1cm內(nèi)甲狀腺組織,作為對(duì)照組,病理類型包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎、正常甲狀腺組織。取材后 20 min內(nèi)迅速保存在液氮中,用于STAT3相關(guān)檢測(cè)。

1.2 主要試劑

Trizol試劑購(gòu)自 Invitrogen 公司。STAT3、pSTAT3、VEGF、Cyclin D1第一抗體均為DAKO產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1總蛋白的提取 分別取甲狀腺癌及癌旁對(duì)照組織各約100 mg,液氮環(huán)境下研磨成粉末,加入Trizol試劑,從有機(jī)相中提取總蛋白,參照Santa Cruz公司提取方法進(jìn)行。

1.3.2Western blot分析 分別將50 μ g蛋白樣品沸水中熱變性,上樣,進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(polyvinyldifluori-de)膜上,Blocking Buffer(5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h。將親和層析純化的小鼠抗人pSTAT3多克隆一抗1∶300稀釋溶于TBST中,4℃與膜孵育過夜,TBST洗膜10 min×3;加入1:300稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗,室溫孵育60 min,TBST洗膜10 min×3;再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的三抗,室溫孵育60 min,TBST洗膜10 min×3,末次用TBS洗膜10 min。加入DAB顯色,待特異性條帶信號(hào)清晰可見時(shí)用Stop Buffer終止染色。特異性條帶的信號(hào)采用上海天能科技有限公司GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)處理。同樣方法分析Cyclin D1、VEGF的蛋白表達(dá)情況。

1.3.3免疫組化分析 標(biāo)本組織均經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋,5 μ m連續(xù)切片,用于STAT3免疫組化檢測(cè)。切片常規(guī)脫蠟、水化后,用3%過氧化氫室溫孵育10 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶?？乖⒉ㄐ迯?fù),冷卻至室溫后,蒸餾水洗,PBS充分洗。正常血清封閉20 min,棄血清后,加入小鼠抗人STAT3多克隆抗體(稀釋度為1∶300)后4℃冰箱過夜。滴加通用型IgG抗體(Fab段)-HRP多聚體,37℃孵育30 min,DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光鏡觀察。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗而其他條件均相同。參考Campbell等[1]的標(biāo)準(zhǔn),采用半定量方法,免疫組化染色以細(xì)胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。按陽性細(xì)胞數(shù)來計(jì)算評(píng)分:著色細(xì)胞少于5%為陰性(-),著色細(xì)胞占5%-25%為弱陽性(+),著色細(xì)胞占26%-50%為陽性(++),著色細(xì)胞大于50%為強(qiáng)陽性(+++)。結(jié)果由兩位高年資的病理科醫(yī)生評(píng)估。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件進(jìn)行,采用Fisher精確檢驗(yàn),P＜0.05作為評(píng)判統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.1.1STAT 3的表達(dá) 在12例甲狀腺癌標(biāo)本中,蛋白表達(dá)陽性者12例,癌旁對(duì)照組3例見陽性表達(dá)25.0%(3/12),兩組比較差異顯著(P＜0.01)。表達(dá)陽性者在90 KD的位置可見相應(yīng)的條帶,如圖1所示。

圖1 pSTAT3蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果

2.1.2相關(guān)因子CyclinD1、VEGF的蛋白表達(dá) 在12例甲狀腺癌標(biāo)本中,Cyclin D1、VEGF蛋白表達(dá)均呈陽性;癌旁對(duì)照組也可見陽性表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)度明顯低于甲狀腺癌組,經(jīng)灰度掃描分析比較,兩組均存在顯著差異(P＜0.01)。如圖2,圖3所示。

圖2 VEGF、Cyclin D1蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果

圖3 VEGF、Cyclin D1蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值分析結(jié)果

2.2STAT3的免疫組織化學(xué)結(jié)果STAT3在甲狀腺癌組織中過表達(dá),陽性信號(hào)主要定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞漿,如圖4所示。STAT3在甲狀腺癌旁組織中不表達(dá)或呈微弱表達(dá)。統(tǒng)計(jì)顯示,12例甲狀腺癌組織中,STAT3陽性率為100%(12/12)。以上結(jié)果與WB檢測(cè)結(jié)果相一致。

3 討論

圖4 STAT3在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá),400×

STAT3是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子家族的重要成員,大量研究表明STAT3與腫瘤的增殖、分化、細(xì)胞凋亡、血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移和免疫逃避密切相關(guān),被定義為新的癌基因[2]。在惡性黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多種腫瘤組織與細(xì)胞系中已證實(shí)存在STAT3的異常表達(dá)和激活。筆者率先報(bào)道了STAT3在人甲狀腺癌組織中的表達(dá),本研究Western blot結(jié)果表明,12例甲狀腺癌組織中pSTAT3蛋白的陽性率為100%(12/12),癌旁對(duì)照組3例見陽性表達(dá)25.0%(3/12),兩組比較差異顯著(P＜0.01)。表明STAT3在人甲狀腺惡性腫瘤中也產(chǎn)生作用,但其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步闡釋。

STAT3轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)和活化轉(zhuǎn)錄的詳細(xì)機(jī)制迄今尚未完全闡明。作為Jaks的下游信號(hào),激活STATs的酪氨酸激酶功能是由與受體結(jié)合的Janus激酶(Jak)所擔(dān)任的[3]。通過上述過程,STAT3將CK激發(fā)的短暫的胞漿信號(hào)轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)期的表達(dá)改變,從而調(diào)控細(xì)胞的多種生理功能。在不同細(xì)胞系中反應(yīng)可不同,STAT3作用于一系列不同的靶基因,持續(xù)的細(xì)胞周期是腫瘤細(xì)胞增殖的重要特點(diǎn)。cyclin D1作為STAT3的下游基因,他們之間的相互作用很復(fù)雜,在Alvarez等[4]的研究報(bào)告中,證明CyclinD1在一定的條件下可被STAT3激活,而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。CyclinD1直接參與了癌腫的形成和存活 ,STAT3的組成性激活有誘導(dǎo)它的作用。我們研究發(fā)現(xiàn)STAT3下游基因Cyclin D1、VEGF在甲狀腺癌組織與癌旁對(duì)照組中的表達(dá)具有顯著的差異性,且STAT3和Cyclin D11、VEGF之間具有明顯的的相關(guān)性。所以提示STAT3可能在甲狀腺癌的發(fā)病機(jī)制中起一定作用。STAT3被異常激活后可能促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增生,抑制細(xì)胞的凋亡,協(xié)助腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程等。其可能機(jī)制是STAT3與 Cyclin D1、VEGF啟動(dòng)子上的STAT3位點(diǎn)結(jié)合,促進(jìn)了甲狀腺組織中癌細(xì)胞的形成及轉(zhuǎn)移。

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,預(yù)后較好,但仍有10%-20%的難治性甲狀腺癌如未分化甲狀腺癌、復(fù)發(fā)甲狀腺癌等利用現(xiàn)有治療手段(手術(shù)、核素、內(nèi)分泌治療)難以取得較好療效,而且甲狀腺癌對(duì)放療、化療不敏感,所以探索基因治療等新的治療方式也成為甲狀腺癌研究的熱點(diǎn)[5]。鑒于STAT3基因在一系列常見腫瘤中起著中心作用,且對(duì)大多數(shù)成人的正常細(xì)胞、組織并不是必須的,所以靶向阻斷STAT3治療惡性腫瘤不但會(huì)是有效的,而且是合理的,在基因治療方面表現(xiàn)出很大的前景。在多種細(xì)胞系和動(dòng)物模型中已經(jīng)證明,通過關(guān)鍵區(qū)域的阻斷劑或RNA干涉等技術(shù)阻斷STAT3的活化能導(dǎo)致腫瘤難以生存和增殖[6]。

綜上,本研究提示在甲狀腺癌中STAT3與Cyclin D1、VEGF作用密切相關(guān),三者可能協(xié)同參與了甲狀腺癌的發(fā)病進(jìn)程,這將有助于加深對(duì)甲狀腺癌的分子發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)。STAT3激活可能是腫瘤發(fā)生的早期事件,參與了Cyclin D1、VEGF基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。因此可以考慮應(yīng)用基因沉默技術(shù)干擾STAT3的表達(dá)或抑制其活性,進(jìn)而抑制惡性腫瘤的發(fā)生或發(fā)展。

[1]Rahaman SO,Harbor PC,Chernova O,et al.Inhibiti on of concstitutively active STAT3 suppresses proliferation and induces apoptosis in glioblastoma multiforme cell[J].Oncogene,2002,21(55):8404.

[2]Bromberg JF,Wrzeszczymska MH,Devgan G,et al.Stat3 as an oncogene[J].Cell,1999,98(3):295.

[3]Darnell JEJr,Kerr IM,Stark GR,etal.Jak-STAT pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins[J].Science,1994,264:1415.

[4]Avarez JV,Febbo PG,Ramaswamy S,et a1.Identification of genetic signiture of activated STAT3 in human tumors[J].Cancer Res,2005,65(12):5054.

[5]DeGroot LJ,Zhang R.Gene therapy for thyroid cancer:where do we stand[J].J Clin Endocrinol Metab,2001,86(7):2923.

[6]Mora LB,Buettner R,Seigne J,et al.Constitutive activation of Stat3 in human prostate tumors and cell lines:direct inhibition of Stat3 signaling induces apoptosis of prostate cancer cells[J].Cancer Res,2002,62(22):6659.