姜慧英,劉 妍

(1.北京京煤集團(tuán)醫(yī)院,北京102300;2.北京佑安醫(yī)院,北京100069)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一種慢性漸進(jìn)性膽汁淤積性肝臟疾病,組織學(xué)是以破壞小膽管為其特征的非化膿性炎癥,并以血清中出現(xiàn)特征性自身抗體為其主要標(biāo)志?？咕€(xiàn)粒體抗體(AMA)是PBC高敏感性血清學(xué)指標(biāo)[1],ANA也在部分PBC患者中出現(xiàn),在核膜型ANA的患者中發(fā)現(xiàn)三種自身抗體,即核心蛋白gp210抗體、核心蛋白p62抗體及核纖層蛋白B受體抗體[2]。本研究小組總結(jié)了抗gp210抗體與核膜型抗核抗體在PBC患者中的意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象以北京佑安醫(yī)院1999-2006年期間收治確診的100例PBC患者作為研究對(duì)象。診斷標(biāo)準(zhǔn):采用2000年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)PBC指導(dǎo)建議[3]。60例AIH患者、50例 HBV患者和50例HCV患者作為疾病對(duì)照組,血庫(kù)隨機(jī)抽取50例獻(xiàn)血員作為正常對(duì)照。AIH采用1999年國(guó)際AIH小組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]結(jié)合評(píng)分系統(tǒng),病毒性肝炎按照2000年“病毒性肝炎防治方案”診斷[5]。

1.2方法(1)間接免疫熒光法檢測(cè)自身抗體(ANA、AMA、SMA、LKM、SLA/LP、LC-1):主要步驟為選擇 HEP-2細(xì)胞和5種組織的冰凍切片作為抗原,采用生物薄片技術(shù)將6種切片組合成一個(gè)反應(yīng)區(qū)。待檢血清自1∶100起稀釋,與組織細(xì)胞孵育30分鐘;加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗體結(jié)合30分鐘;洗片、封片后熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果。組織細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)特異性綠色熒光、血清稀釋度＞1∶100為陽(yáng)性。予以檢測(cè)抗核抗體(ANA)、抗線(xiàn)粒體抗體(AMA)、抗平滑肌抗體(SMA)和抗肝腎微粒體抗體(LKM)等自身抗體。(2)免疫印記法(EUROLINE)檢測(cè)gp210抗體:將膜條放入溫育槽中,每槽加1.5 ml標(biāo)本緩沖液,在搖床溫育5 min,倒掉槽內(nèi)液體。血清1∶100稀釋后加入溫育槽中在搖床溫育30 min后倒掉槽內(nèi)液體,在搖床上用1.5 ml洗液清洗膜條3次,每次5 min。在槽中加入1.5 ml已稀釋酶結(jié)合物,在搖床上溫育30 min,倒掉槽內(nèi)液體。洗液清洗膜條。槽中加入1.5 ml底物,在搖床溫育10 min,用蒸餾水清洗。將膜條置于結(jié)果判定模板中用免疫印記掃描儀讀取。所有試劑均采用德國(guó)EUROIMMUN實(shí)驗(yàn)免疫試劑盒。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS軟件,計(jì)數(shù)資料采用行×列χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1100例PBC患者自身抗體特點(diǎn)ANA陽(yáng)性60例(60%),滴度從 1∶100-1∶3 200不等:其中核膜型 35 例,核點(diǎn)型13例,著絲點(diǎn)型10例,核點(diǎn)合并核膜型2例。AMA陽(yáng)性100例。3例SMA陽(yáng)性。gp210陽(yáng)性33例,gp210陰性67例。

2.2gp210陽(yáng)性組與陰性組ANA滴度及核型比較(1)gp210陽(yáng)性組與陰性組ANA滴度比較:gp210陽(yáng)性組:ANA陽(yáng)性33例(1∶100-1∶3 200不等),AMA均陽(yáng)性;gp210陰性組:ANA陽(yáng)性27例(1∶100-1∶3 200不等),ANA陰性40例,27例中1例SMA陽(yáng)性。陽(yáng)性組與陰性組ANA滴度比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。(2)gp210陽(yáng)性組與陰性組ANA核型比較:gp210陽(yáng)性組ANA核型分析:30例(90.9%)表現(xiàn)核膜型,2例核膜合并核點(diǎn)型,1例著絲點(diǎn)型。gp210陰性組ANA核型分析:核點(diǎn)型13例(19.4%),9例著絲點(diǎn)型(13.4%),5例核膜型。見(jiàn)表2。

表1 gp210陽(yáng)性組與陰性組ANA滴度比較(例,%)

表2 gp210陽(yáng)性組與陰性組ANA核型比較(例,%)

2.3PBC、AIH、HBV、HCV、BD各組gp210陽(yáng)性數(shù)及陽(yáng)性率

100例PBC患者中,gp210陽(yáng)性率為33%,明顯高于AIH患者的陽(yáng)性率(13%),而HBV、HCV、BD各組gp210陽(yáng)性率均為0。(見(jiàn)表3)

表3 PBC、AIH、HBV、HCV、BD各組gp210陽(yáng)性數(shù)及陽(yáng)性率比較

2.4PBC、AIH、HBV、HCV、BD各組ANA陽(yáng)性數(shù)及核膜型ANA例數(shù)比較(見(jiàn)表4)

表4 PBC、AIH、HBV、HCV、BD各組 ANA陽(yáng)性數(shù)及核膜型ANA例數(shù)比較

2.5gp210陽(yáng)性組與陰性組生化指標(biāo)比較(1)gp210陽(yáng)性患者與陰性患者一般資料比較:33例gp210陽(yáng)性患者與67例gp210陰性患者,兩組男性與女性比例分別為5∶11和20∶64,兩組均以女性發(fā)病為主。gp210陽(yáng)性患者組發(fā)病年齡33-70(56.9±10.62)歲,gp210陰性患者組發(fā)病年齡34-84(54.24±12.45)歲,兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。gp210陽(yáng)性組與陰性組患者,兩組患者發(fā)病年齡分布比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(2)gp210陽(yáng)性患者與陰性患者生化指標(biāo)比較:gp210陽(yáng)性患者與陰性患者 ALT、AST、Tbil、GGT、ALP、IgG、IgA、IgM 水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)表5。(3)gp210陽(yáng)性患者與陰性患者肝硬化發(fā)生率比較:gp210陽(yáng)性患者肝硬化發(fā)生率(28/33例,84.8%)明顯高于陰性患者(33/67例,49.3%)(P＜0.01)。

表5 gp210陽(yáng)性患者與陰性患者生化指標(biāo)比較(s)

表5 gp210陽(yáng)性患者與陰性患者生化指標(biāo)比較(s)

組別 例數(shù) ALT(U/L)AST(U/L)Tbil(umol/l)GGT(U/L)ALP(U/L)IgG(g/l)IgA(g/l)IgM(g/l)陽(yáng)性 33 61.9±10.2 70.8±43.5 5.57±8.9 181±105 245±115.5 20.4±10.5 3.98±1.8853.56±2.440陰性 67 154±130 145.8±136.84.82±6.8 265±301 244±192.9 16.9±6.34 3.49±1.6774.32±2.604 P值 0.087 3 0.131 2 0.391 2 0.193 0.195 0.098 9 0.127 0 0.187

3 討論

近年來(lái),隨著自身抗體檢測(cè)水平的不斷提高,我國(guó)PBC的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),因此對(duì)PBC的早期發(fā)現(xiàn)和臨床診斷顯得尤為重要。AMA、M2是目前公認(rèn)的診斷PBC重要的血清學(xué)指標(biāo),部分PBC患者會(huì)出現(xiàn)高滴度ANA,PBC患者ANA滴度及其核型是否對(duì)PBC的診斷有意義成為我們研究的焦點(diǎn)。由于AMA-M2指標(biāo)對(duì)PBC的診斷存在一定的局限性,少部分PBC患者AMA陰性,因此本課題小組用免疫印記法檢測(cè)了100例PBC患者的自身抗體,其中包括Ko、Ro-52、SLA/LP、LC-1、LKM-1、gp210、PML、Sp100、3E(BPO)等多種自身抗體,現(xiàn)選擇抗gp210抗體進(jìn)行了分析。

本研究在100例PBC患者中檢測(cè)到33例gp210陽(yáng)性,疾病對(duì)照組60例AIH患者中8例gp210陽(yáng)性,對(duì)這8例患者的臨床資料重新評(píng)價(jià)后發(fā)現(xiàn)其中4例為PBC/AIH重疊綜合征,另4例是否是AMA陰性的PBC患者有待追蹤,而HBV、HCV、BD組gp210均陰性,因此可以推斷抗gp210抗體是PBC特異性自身抗體,和國(guó)內(nèi)[6]、國(guó)外[7]的研究結(jié)論相符。

象其他自身免疫性疾病一樣,部分PBC患者除出現(xiàn)AMA外也可出現(xiàn)ANA,利用間接免疫熒光法,ANA可出現(xiàn)多種熒光模式:核點(diǎn)型、核膜型、均質(zhì)型、著絲點(diǎn)型、核仁型等。本研究提示gp210陽(yáng)性組與陰性組ANA滴度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但gp210陽(yáng)性組與陰性組ANA核型比較有明顯差異:gp210陽(yáng)性組主要表現(xiàn)核膜型(90.9%),其次 2/33(6.1%)表現(xiàn)核膜合并核點(diǎn)型,1/33表現(xiàn)著絲點(diǎn)型;而gp210陰性組19.4%表現(xiàn)核點(diǎn)型,13.4%表現(xiàn)著絲點(diǎn)型,7.5%表現(xiàn)核膜型。推斷核膜型ANA是PBC特異性核型。

表現(xiàn)為核膜型熒光染色型的抗核包膜蛋白抗體包括抗gp210、p62、抗核板層B受體抗體等?？筭p210抗體的靶抗原為位于核孔復(fù)合物上的210kD跨膜糖蛋白,所識(shí)別的表位是gp210羧基末端上的15個(gè)氨基酸殘基。從表4結(jié)果來(lái)看,100例PBC患者中60例出現(xiàn)ANA,并且30例(50%)為核膜型ANA,而60例AIH患者中盡管ANA出現(xiàn)的比例高,但是核膜型ANA只有4例,這4例重新評(píng)價(jià)臨床資料后為AIH/PBC重疊綜合癥,HBV、HCV、BD組沒(méi)有ANA的出現(xiàn),說(shuō)明核膜型ANA是PBC特異性自身抗體核型。Luettig等研究者[7]對(duì)因PBC而進(jìn)行肝移植手術(shù)患者的隨訪(fǎng)中,發(fā)現(xiàn)患者在移植術(shù)后盡管ANA的滴度明顯下降,但是血清中ANA卻持續(xù)存在而且ANA的免疫熒光反應(yīng)模式也未改變。進(jìn)一步提示核膜型ANA是特異性自身抗體,在病變靶器官去除的情況下該抗體仍然存在。

抗gp210抗體不僅可與抗線(xiàn)粒體抗體同時(shí)出現(xiàn),文獻(xiàn)報(bào)道抗gp210抗體也存在于20%-47%AMA陰性的PBC患者中[8],對(duì)于臨床、生化和組織學(xué)表現(xiàn)疑似PBC而AMA陰性的患者,或AMA陽(yáng)性而臨床癥狀不典型、存在重疊綜合征(如與干燥綜合征重疊)的患者,抗gp210抗體檢測(cè)有重要價(jià)值。另外gp210陽(yáng)性患者肝硬化發(fā)生率明顯高于陰性患者(P＜0.01),因此該抗體陽(yáng)性提示患者預(yù)后不良,抗gp210抗體可作為PBC患者的預(yù)后指標(biāo)。所以測(cè)定gp210抗體并結(jié)合ANA熒光模式可以提高PBC的診斷率。我們收集的PBC患者AMA均陽(yáng)性,因此我們有待增加這部分病例資料。

隨著檢測(cè)手段的提高,越來(lái)越多新的自身抗體被發(fā)現(xiàn),自身抗體的聯(lián)合檢測(cè)將使更多的PBC患者得到早期診斷和正確治療。

[1]Omagari K,Hazama H,Kohno S.Enzyme inhibition assay for pyruvate dehydrogenase complex:clinical utility for the diagnosis of primary biliary cirrhosis[J].World J Gastroenterol,2005,11:6735.

[2]Invernizzi P,Selmi C,Ranftler C,et al.Antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis[J].Semin Liver Dis,2005,25:298.

[3]Heathcote EJ.The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines[J].Hepatology,2000,31:1005.

[4]Alvarez F,Berg PA,Bianchi FB,et al.International Autoimmune Hepatitis Group Report:review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis[J].J Hepatol,1999,31:929.

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志,2000,8(6):324.

[6]李永哲,劉 鐳,孫慶國(guó),等.核包膜蛋白gp210、p62和LBR自身抗原基因克隆表達(dá)及其抗體診斷原發(fā)性膽汁性肝硬化的價(jià)值初探[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2005,28:1120.

[7]Luettig B,Boeker KH,Schoessler W,et al.The antinuclear autoantibodies Sp100 and gp210 persist after orthotopic liver transplantation in patients with primary biliary cirrhosis[J].J Hepatol,1998,28:824.

[8]Vergani D,Bogdanos,DP.Positive markers in AMA-negative PBC[J].Am J Gastroenterol,2003,98(2):241.