黃立娟,宋 輝,孫文杰

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,黑龍江哈爾濱150086)

急性冠脈綜合征(ACS)是以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或侵蝕,繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成的一組臨床綜合征。近年來(lái)在ACS患者的粥樣斑塊和外周血中發(fā)現(xiàn)了CD+CD28-T細(xì)胞,并認(rèn)為CD+CD28-T細(xì)胞在ACS患者斑塊破裂中可能具有直接的作用。因此研究CD+CD28-T細(xì)胞對(duì)探討其在ACS患者斑塊破裂中的作用具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

(1)急性冠脈綜合癥(ACS)組:臨床上選擇符合ACS診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者30例。根據(jù)心絞痛發(fā)作性質(zhì)、持續(xù)時(shí)間、程度,以及 CK-MB、TnI檢查診斷為不穩(wěn)定心絞痛或急性心肌梗死。所有患者均行冠狀動(dòng)脈造影檢查證實(shí)有冠狀動(dòng)脈疾病。(2)穩(wěn)定型心絞痛(SAP)組:選擇有典型的勞累性胸痛,休息或含服硝酸甘油后緩解的患者30例,所有患者至少一個(gè)主要冠狀動(dòng)脈50%以上的狹窄,且沒(méi)有全身性炎癥或心肌炎癥。(3)正常對(duì)照組:健康體檢者20例,無(wú)冠狀動(dòng)脈疾病病史,并經(jīng)常規(guī)心電圖及實(shí)驗(yàn)室檢查確認(rèn)無(wú)心腦血管等疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1主要試劑和設(shè)備 FITC-CD28 mAb,PerCPCD3 mAb,PE-CD4 mAb,PE-CD28 mAb,PerCP-CD4 mAb和PHA-P(美國(guó)Biolegend公司),FITC-anti-human CD161 mAb(美國(guó)Ancell公司),CD4 Negative Isolation Kit(Dynal Biotech USA),Postive Selection Human FITC Selection Kit(Empty Roboccp Stemcell),乳酸脫氫酶(LDH)釋放法定量檢測(cè)試劑盒(上海勁馬生物技術(shù)有限公司)。磁極(Easyse),流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司FACSort),酶標(biāo)儀(美國(guó)BD公司)。

1.2.2外周血CD+CD28-T細(xì)胞數(shù)量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)設(shè)實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管。實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管分別加入新鮮全血 100 μ l。實(shí)驗(yàn)管加入 20 μ l PerC-CD3 mAb,PECD4單抗和FITC-CD28 mAb,對(duì)照管加入20 ml同型對(duì)照抗體,混勻,室溫避光孵育30 min,加入紅細(xì)胞裂解液,1 000 r/min離心5 min,棄上清。用PBS洗滌,1 000 r/min離心5 min,棄上清,用1%多聚甲醛PBS固定10 min。流式細(xì)胞儀分析CD+CD28-T細(xì)胞的白分比。

1.2.3外周血CD+CD28-T細(xì)胞表達(dá)CD161的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)設(shè)實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管。實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管分別加入新鮮全血 100 μ l,實(shí)驗(yàn)管加入 20 μ l PerCP-CD4 mAb,PE-CD28 mAb和FITC-CD161 mAb,對(duì)照管加入20μ l同型對(duì)照抗體,后面步驟同上。用流式細(xì)胞儀分析CD+CD28-和CD4+CD28+細(xì)胞CD161的表達(dá)。

1.2.4CD+CD28-T細(xì)胞克隆表達(dá)CD161測(cè)定

1.2.4.1分離CD+CD28-T細(xì)胞和CD4+CD28+T細(xì)胞采靜脈血(EDTA抗凝)50 ml,用免疫磁珠分選法分離CD+CD28-T細(xì)胞和CD4+CD28+T細(xì)胞。按說(shuō)明書操作。用流式細(xì)胞儀對(duì)CD+CD28-T和CD4+CD28+T細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定,方法同CD+CD28-T細(xì)胞的測(cè)定。

1.2.4.2CD+CD28-T和CD4+CD28+T細(xì)胞克隆采用有限稀釋法將免疫磁珠法分離到的CD+CD28-和CD4+CD28+T細(xì)胞分別進(jìn)行克隆,在克隆好的CD+CD28-和CD+CD28-T細(xì)胞懸液加入IL-12,調(diào)整培養(yǎng)液的濃度,IL-12終濃度為20 μ/ml,培養(yǎng)48小時(shí)。

1.2.4.3CD+CD28-細(xì)胞克隆CD161表達(dá)的測(cè)定具體操作同外周血CD161測(cè)定。用流式細(xì)胞儀分析CD+CD28-和 CD4+CD28+T細(xì)胞刺激前后CD161的表達(dá)。

1.2.5CD+CD28-T細(xì)胞溶解內(nèi)皮細(xì)胞的功能 用乳酸脫氫酶釋放法

1.2.6統(tǒng)計(jì)結(jié)果處理 用SPSS軟件分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示,采用兩組間資料的t檢驗(yàn)分析,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性冠脈綜合征患者外周血CD+CD28-T細(xì)胞的數(shù)量

正常對(duì)照組、SAP組和ACS組的CD4+CD28-T細(xì)胞的數(shù)量見(jiàn)表1?？梢钥闯鯝CS組CD4+CD28-細(xì)胞比例比正常對(duì)照組和SAP組顯著增加(P＜0.05)。

表1 外周血 CD+CD28-T細(xì)胞數(shù)量(%,s)

表1 外周血 CD+CD28-T細(xì)胞數(shù)量(%,s)

注:*與正常對(duì)照組,SAP組比較P＜0.01

分組 正常對(duì)照組(n=20)SAP組(n=30)ACS組(n=30)CD+CD28-T 1.75±1.55 3.64±1.33 15.55±5.76*

2.2 急性冠脈綜合征患者外周血CD+CD28-T細(xì)胞表達(dá)CD161

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,ACS組CD+CD28-T細(xì)胞CD161的表達(dá)顯著高于CD4+CD28+T細(xì)胞CD161的表達(dá)(圖1)。

2.3 IL-12刺激后CD+CD28-T細(xì)胞克隆CD161的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,未加IL-12刺激細(xì)胞克隆后的CD+CD28-和CD4+CD28+細(xì)胞都不表達(dá)CD161。而用IL-12刺激細(xì)胞克隆后,CD+CD28-細(xì)胞高表達(dá)CD161,CD4+CD28+細(xì)胞幾乎不表達(dá)CD161(圖2)。

2.4 CD+CD28-T細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷能力

效靶比為5∶1時(shí),CD+CD28-T細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷活性(43.32±2.32)%顯著高于CD4+CD28+T細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷活性(4.98±0.45)%值(P＜0.01)。效靶比為20∶1時(shí),CD+CD28-T細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷活性(51.31±3.12)%顯著高于CD4+CD28+T細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的殺傷活性(5.01±0.33)%值(P＜0.01)。與CD4+CD28+T細(xì)胞相比,CD+CD28-T細(xì)胞隨著效靶比增高殺傷活性明顯增強(qiáng)(P＜0.05)(表2)。

圖1 外周血CD+CD28-T細(xì)胞表達(dá)CD161的情況

圖2 CD4+CD28+T細(xì)胞和CD+CD28-T細(xì)胞克隆CD161的表達(dá)

表2 CD+CD28-T對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞殺傷作用(%,s)

表2 CD+CD28-T對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞殺傷作用(%,s)

注:*與CD4+CD28+組比較(comparation with CD4+CD28+group)P＜0.01

分組 5∶1 20∶1 CD4+CD28+T組 4.98±0.45 5.01±0.33 CD+CD28-T組 43.32±2.32* 51.31±3.12*

3 討論

多數(shù)研究表明在強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病中CD+CD28-T細(xì)胞顯著增高[2-4]。血液淋巴細(xì)胞的激活,炎性因子的增多和內(nèi)皮細(xì)胞間的炎性細(xì)胞反應(yīng)造成急性冠脈綜合征患者免疫系統(tǒng)的異常,這在ACS的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[5,6]。Chapman等[7]對(duì)CD+CD28-淋巴細(xì)胞特性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在缺乏CD28信號(hào)時(shí),能被抗CD3單抗激活并產(chǎn)生高水平的炎性細(xì)胞因子IL-2和 IFN-γ,提示CD+CD28-T淋巴細(xì)胞是一種促炎性反應(yīng)細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn),CD+CD28-T淋巴細(xì)胞在急性冠脈綜合征患者外周血中異常增多,提示ACS的發(fā)生發(fā)展可能與CD+CD28-T淋巴細(xì)胞亞群的作用密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示外周血CD+CD28-T細(xì)胞顯著高于正常對(duì)照組和穩(wěn)定性心絞痛組。同時(shí)檢測(cè)了CD+CD28-T細(xì)胞是否表達(dá)CD161。研究結(jié)果表明,CD161在ACS患者外周血CD+CD28-T細(xì)胞上的表達(dá)顯著高于在CD4+CD28+T細(xì)胞上的表達(dá)。這說(shuō)明缺失了CD28分子的CD4+T細(xì)胞獲得了另一種新的表達(dá),具有同NK細(xì)胞相同的表面標(biāo)志。而未用IL-12刺激細(xì)胞克隆的 CD+CD28-T細(xì)胞不表達(dá)CD161,用IL-12刺激細(xì)胞克隆后的CD+CD28-T細(xì)胞高表達(dá)CD161。這種現(xiàn)象說(shuō)明在ACS患者體內(nèi)的CD+CD28-T細(xì)胞是受某種因素刺激而獲得了CD161的表達(dá),使得該細(xì)胞在體內(nèi)處于活化狀態(tài)。

用CD4+CD28+T細(xì)胞和處于活化狀態(tài)的CD+CD28-T細(xì)胞分別與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),檢測(cè)兩種細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的溶解能力。結(jié)果表明,CD+CD28-T對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有很高的溶解作用,顯示出很強(qiáng)的細(xì)胞毒功能,而CD4+CD28+T細(xì)胞沒(méi)有這種功能。在增加效靶比后,CD+CD28-T細(xì)胞溶解內(nèi)皮細(xì)胞的作用增強(qiáng),而CD4+CD28+T細(xì)胞的作用無(wú)變化,這說(shuō)明內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度與CD+CD28-T細(xì)胞濃度有關(guān)。因此,ACS患者體內(nèi)異常的CD+CD28-T細(xì)胞增高以及增高的程度可能與疾病的嚴(yán)重性有關(guān)。

綜上所述,CD+CD28-T細(xì)胞可能通過(guò)不同途徑對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用。本研究證實(shí)了急性冠脈綜合征患者增多的CD+CD28-T細(xì)胞在體內(nèi)處于活化狀態(tài),具有細(xì)胞毒活性,這種細(xì)胞毒活性對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有溶解作用,從而導(dǎo)致粥樣斑塊下內(nèi)皮糜爛,引起斑塊破裂,造成急性事件的發(fā)生。這一研究為臨床在治療和預(yù)防ACS提供了新的思路,具有十分重要的意義。

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