李冬梅,宓宇仙*,倪勁松,楊 柳

(1.吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院 特診科,吉林吉林132022;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林 長春130021)

1974年Hamby等[1]通過進(jìn)一步病理研究首次提出了糖尿病心肌病的概念。糖尿病心肌病是一個(gè)獨(dú)立的糖尿病并發(fā)癥,其發(fā)病與高血壓、冠狀動(dòng)脈疾病或其他已知心臟疾病無關(guān),是糖尿病發(fā)病過程中特異性的心肌受損和心臟功能改變,可不伴有缺血性病變、血管病變及高血壓等并發(fā)癥,臨床以左心室肥厚和舒張功能不全為主,隨著病程進(jìn)展出現(xiàn)收縮功能不全[2]。實(shí)驗(yàn)證明在糖尿病動(dòng)物模型中存在心肌細(xì)胞凋亡[1,3]。因此細(xì)胞凋亡在糖尿病心肌病變中所起的作用是日益被專家學(xué)者重視。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)性糖尿病心肌病大鼠模型,觀察糖尿病心肌病時(shí)caspase-3的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 糖尿病動(dòng)物模型的制備及分組

清潔級(jí)健康Wistar雄性大鼠16只,鼠齡5-6個(gè)月,體重200±20 g,由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(中心許可證號(hào):SCXK吉 2003-001)。常規(guī)喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分成對(duì)照組(6只)和糖尿病組(10只)。糖尿病組大鼠以60 mg/kg劑量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1 mol/l、PH=4.4的枸櫞酸鹽緩沖液配制),正常對(duì)照組大鼠注射等體積的枸櫞酸鹽緩沖液。注射后48 h取尾靜脈血,測血糖、尿糖情況;并定期隨機(jī)用血糖試紙監(jiān)測血糖的變化。12周后處死大鼠,切取心室肌組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及免疫組織化學(xué)染色。注射STZ糖尿病組大鼠在48小時(shí)檢測血糖值均＞16.7 mmol/L,尿糖(+++-++++)。其中糖尿病組有一只大鼠極度消瘦死亡。

1.2 免疫組織化學(xué)S-P染色

光鏡下caspase-3表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核,以黃色、棕色、棕褐色為陽性表達(dá),其表達(dá)結(jié)果由染色細(xì)胞數(shù)評(píng)判:分別隨機(jī)觀察每例高倍鏡(×400)下5個(gè)視野,計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11軟件,應(yīng)用 t檢驗(yàn),χ2檢驗(yàn)處理數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果用s表示。

2 結(jié)果

免疫組化染色結(jié)果:caspase-3表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核,糖尿病組陽性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組,P＜0.000 1,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 糖尿病組與對(duì)照組caspase-3表達(dá)陽性率比較

3 討論

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡,是由一系列基因調(diào)控的細(xì)胞自主的死亡過程。細(xì)胞凋亡的過程受多種基因調(diào)控,表現(xiàn)為凋亡信號(hào)通路的啟動(dòng)和相關(guān)基因的表達(dá)[4]。糖尿病患者在無明顯微血管病變時(shí)也可出現(xiàn)心力衰竭,表明糖尿病患者心肌細(xì)胞本身可以發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能改變,提示有心肌病的可能[2]。Cai等[5]報(bào)道在糖尿病患者和動(dòng)物模型中都可觀察到心肌細(xì)胞死亡。研究表明在哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡過程中天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspases)家族的激活起關(guān)鍵作用。細(xì)胞凋亡過程實(shí)際上是caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過程。

目前認(rèn)為caspase是一切凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路,各種caspase如同凝血因子一樣”瀑布式”層層激活,最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[6]。Caspase-3是 caspase家族中比較重要的一員,它能分解細(xì)胞蛋白,起凋亡執(zhí)行器的作用。已有的研究表明,caspase-3是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的“核心”蛋白酶,也是凋亡發(fā)生的標(biāo)志酶[7]。caspase-3的作用主要包括:(1)消化破壞細(xì)胞內(nèi)多種蛋白酶復(fù)合體;(2)激活內(nèi)核酸酶,造成DNA裂解破壞形成DNA片斷;(3)通過特異地消化ATPase4b亞基,破壞細(xì)胞鈣泵功能,造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載,上述作用的綜合結(jié)果造成細(xì)胞不可逆性損傷,形成凋亡[8]。

本實(shí)驗(yàn)觀察了Caspase-3的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:caspase表達(dá)于心肌細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞核,對(duì)照組心肌細(xì)胞caspase-3表達(dá)弱,陽性表達(dá)率為9.94%;糖尿病組心肌細(xì)胞caspase-3呈強(qiáng)陽性表達(dá),陽性表達(dá)率92.42%,明顯高于對(duì)照組。說明caspase-3參與了心肌細(xì)胞的凋亡。因此心肌細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致糖尿病心肌病及心力衰竭的重要原因之一。

[1]Hamby RI,Zoneraich S,Sherman L,et al.Diabetic cardiomyopathy[J].JAMA,1974,229(13):1749.

[2]Schannwell CM,SchneppenheimM,Perings S,et al.Left ventricular diastolic dysfunction as an early manifestation of diabetic cardiomyopathy[J].Cardiology,2002,98(1-2):33.

[3]Rubler S,dlugash J,Yuceoglu YZ,et al.New type of cardiomyopathy ass ociated with diabetic glomerulosclerosis[J].Am J Cardiol,1972,30(6):595.

[4]令 華.心肌損害與糖尿病相互關(guān)系的探討[J].放射免疫學(xué)雜志,1996,9,(3):129.

[5]Zhu XX,ZhouXp,Zhong XL,et al.Streptozotocin induced cardiom-yopathy in diabetic rats[J].Chin Med Engl,1993,106(3):463.

[6]Martin DA,Siegel RM,Zheng L,et al.Mebrane oligomrization and cleavage activates the caspase-8(FLICE/MACHa1)death signal.J Biol Chem,1998,273(8):4345.

[7]Higuchi M,Aggarwal B B,Yeh E T.Activationof CPP 32-like rtoteaes in tumor necrosis factor-inducedd apoptosis is dependent on mitochondrial runction[J].J Clin Invest,1997,99(7):1751.

[8]Donovan M,Cotter T G.Control of mitochondrial integrity by Bcl-2 family members and caspase-independent cell death[J].Biochim Biophys Acta,2004,1644,(2-3):133.