孫樹東,婁 楠,王 巖,趙建武

(1.吉林大學第二醫(yī)院骨科,吉林長春130041;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科;3.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院基因診療中心)

骨肉瘤無論從臨床角度還是分子生物學角度來講都是一個異質(zhì)性的腫瘤,而其一直就采用間充質(zhì)的分化標準來進行分級。盡管目前在醫(yī)學研究和外科手術(shù)上都取得了長足的進步,但對于高危骨肉瘤的死亡率仍然停滯在30%到50%,而如何針對其近年來已有學者通過骨肉瘤的研究,使用單細胞克隆篩選的方法,以圖得到高侵襲,高致瘤的細胞亞群。而我們采用先分離得到holoclone后通過多個成骨細胞分化標志物的檢測,得到高侵襲及高致瘤的骨肉瘤細胞株。并對這些骨肉瘤細胞株進行了一系列的鑒定試驗。而通過觀察我們發(fā)現(xiàn)能夠形成“holoclone”的惡性腫瘤細胞是腫瘤中的真正致瘤部分,而這些細胞株形成的克隆更小,具有很高的克隆形成能力和更強的粘附能力[1,2]。其成骨分化標志物表達更趨近于未分化狀態(tài)。

1 材料和方法

1.1 材料

人成骨肉瘤細胞MG-63購自ATCC。高糖DMEM(H-DMEM)Gibico USA優(yōu)等胎牛血清(FBS)Hyclone USA胰酶Promega USA DMSO天佳生物科技有限公司China DEPC鼎國生物科技有限公司China Trizol InvitrogenUSA TaKaRa RT-PCRKit TaKaRa Japan Marker 1500 Takara Japan Taq DNA聚合酶TAKARA Japan CCk-8碧云天生物研究所CHINA

1.2 克隆篩選

采用有限稀釋法,將對數(shù)生長期的骨肉瘤MG-63細胞在96孔板中稀釋成每孔含0.5-1個細胞,在克隆化后3-5 d選出僅含有單個細胞生長的并生長成完全克隆的孔進行標記,待細胞增殖至孔面積1/3時(即細胞數(shù)超過600個),將細胞移至24或48孔板中擴大培養(yǎng),后再轉(zhuǎn)至6孔板,最后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶,后行細胞功能實驗鑒定。

1.3 生物學特性鑒定

1.3.1形態(tài)學 相差顯微鏡拍攝有限稀釋法分離得到的各單克隆細胞亞系的細胞形態(tài)。

1.3.2細胞增殖率測定 用96孔板接種細胞數(shù)為103/孔,連續(xù)計數(shù) 7 d,繪制生長曲線。采用Cell Counting Kit-8(CCK8)分析骨肉瘤細胞增殖。每組取6個復孔,將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中,在37℃,5%CO2及95%濕度條件下,培養(yǎng)24 h。每孔加CCK-8試劑10 μ l,放入CO2孵箱中孵育2 h,酶標儀波長450 nm,讀取光密度OD值。記錄結(jié)果(細胞OD值=細胞孔OD值-清零組OD值)。以不同單克隆亞系為橫坐標,細胞增殖百分率(%)為縱坐標(以0 h增值率作為100%),使用Microsoft Excel軟件繪制細胞生長曲線。

1.3.3軟瓊脂集落形成試驗 取37℃保溫的不同密度的細胞懸液9.4 ml移入小燒杯中,加入50℃5%瓊脂0.6 ml,迅速混勻,立即澆入鋪有底層瓊脂(濃度為0.3%)的24孔培養(yǎng)板中,每孔加0.8 ml,置室溫使瓊脂凝固,每孔細胞數(shù)為100,接種14 d后,計算克隆數(shù),每個集落細胞數(shù)≥50時為1個克隆。

1.3.4細胞周期檢測 ①取傳代生長良好的對數(shù)生長期細胞,0.25%胰酶消化收集細胞。加入4℃預冷的75%乙醇固定24 h,預冷PBS洗兩次,1 000 rpm離心5 min,調(diào)整細胞濃度為1×106/mL。加入0.5 ml碘化丙啶(50 μ g/mL),4℃避光染色 30 min。流式細胞儀分析,在波長為488 nm、300 mv氬離子激光條件下,每份樣品檢測1×104/ml個細胞。

1.3.5RT-PCR 將選定細胞株分別接種24孔板,培養(yǎng)至對數(shù)生長期。胰酶消化制備細胞懸液,細胞裂解液加超聲裂解細胞離心后取上清(各株分 5組)。按試劑盒說明操作。

1.3.6統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行t檢驗,P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 細胞單克隆

96孔板中成功分離單細胞生長的約為60個,其中有23個克隆成功傳至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)生長,余者皆發(fā)生凋亡或無法繼續(xù)傳代,在同等培養(yǎng)情況下,傳至8-12代又有3個單克隆細胞亞系出現(xiàn)自發(fā)性的死亡,而無法繼續(xù)傳代。而分離出各單克隆細胞亞系的細胞大體形態(tài)差異顯著。

2.2 細胞增殖

我們選取大體形態(tài)具有代表性的8個單克隆細胞株進行細胞生長曲線的測定,其中A3的倍增時間明顯短于其他單克隆細胞株,存在明顯差異。選取細胞都在4-16代之間,每次實驗各克隆選取的細胞均為同一代次。而其中D1克隆則隨著代次的增加,細胞增殖速度逐漸加快。圖1為8個單克隆細胞株第四代的生長曲線。

圖1 不同分化骨肉瘤細胞的生長曲線

2.3 細胞形態(tài)學

多數(shù)克隆與克隆前相似,以短梭形和多邊形為主,細胞排列緊密,胞體大,突起細長,無接觸抑制,易于堆疊,結(jié)團,A3形體稍小。另一類呈長梭形(A1,F1)胞體小,胞漿豐富,突起寬而短,有一定接觸抑制,容易形成單細胞層

2.4 克隆形成率

D1細胞株形成的克隆數(shù)量最多,而最為顯著的是D1的大克隆形成數(shù)目明顯高于其他細胞株細胞。A3的克隆形成能力也明顯高于母系MG63克隆率形成率。其中14天后觀察A3 19.5%;D1 24.2%;大克隆形成率3%,MG63 4.3%.

2.5 成骨分化標志物的RT-PCR檢測

A3細胞株OCN呈低表達,VEGF高表達,stathmin高表達,ALP低表達。

2.6 細胞周期分析

A3細胞株處于DNA合成期(S)的細胞數(shù)明顯增多,而A1 D1細胞株的細胞大多處于GO/G1期,但S期的細胞數(shù)也明顯多于MG63。

3 討論

細胞株指的是從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法得到的同一細胞起源的細胞群[3]。在本實驗的單細胞克隆篩選過程中,我們首先選取了被稱為“Holoclone”的一類的克隆,而所謂的“Holoclone”是從克隆形態(tài)上就是指結(jié)構(gòu)致密呈圓形或者橢圓形的克隆,很多學者研究表明形成不同克隆的腫瘤細胞,其具有完全不同的增殖、分化及成瘤能力。而這種情況也在乳腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腫瘤中得到了驗證。這充分說明不同的腫瘤克隆形態(tài)根本就是不同的腫瘤分子聚合體的表現(xiàn)形式。而人成骨肉瘤MG-63細胞系是Billian切取高加索男孩骨肉瘤組織于體外連續(xù)傳代培養(yǎng)建立的,并經(jīng)過相關(guān)生物學鑒定。并非單細胞起源存在異質(zhì)性。我們認為其應該具有更明顯的腫瘤細胞間的差異。人成骨肉瘤細胞系MG63是具有成骨細胞的表型特征的細胞系,因此我們推斷異質(zhì)的細胞系各個細胞組分其具有不同的成骨分化程度,而其成骨分化標志物的表達也必然有所不同[4]。

經(jīng)過對一系列的成骨分化標志物(如ALP、OCN、OPN、Stathmin)mRNA和蛋白水平上的檢測,發(fā)現(xiàn)由MG63分離而來的多個單克隆細胞株確實在一部分成骨分化標志物的表達量上存在非常顯著的差異,我們認為此類成骨分化標志物的檢測可以作為判斷臨床骨肉瘤惡性程度的早期診斷標準。

而我們通過對ALP、OCN、OPN 、Stathmin等成骨細胞標志物的檢測和所選取的幾個代表性細胞株在大體形態(tài)、周期時相、集落形成、運動能力等方面具有明顯的差異。軟瓊脂集落形成能力是衡量惡性腫瘤成瘤能力的重要指標[5],表示細胞錨著依賴性的喪失;細胞遷移、侵襲及粘附鋪展實驗是目前檢測細胞運動能力的最為常用也是最為可靠的方法,反映腫瘤細胞在體內(nèi)脫離原發(fā)器官的細胞外基質(zhì)、侵襲而遠處播散成瘤的能力;其中我們得到的細胞株D1的成瘤能力明顯高于其他細胞株及母系MG-63.最后裸鼠體內(nèi)的致瘤實驗最直接地反映了各細胞株的惡性程度,細胞株之間存在著的這些細胞表型差異,對于調(diào)整和明確高侵襲、早轉(zhuǎn)移的高度危險性骨肉瘤的早期診斷標準的調(diào)整很有意義。

近年來腫瘤干細胞學說已經(jīng)對于很多高度惡性的異質(zhì)性腫瘤的病因做出了解釋,有學者通過懸浮成球?qū)嶒?克隆形成等一系列實驗能夠證明確實在骨肉瘤細胞中有一個很小的細胞亞群具有自我更新能力,而通過本次研究我們推測具有高侵襲和高致瘤能力的細胞株A3、D1很可能為富集骨肉瘤類干細胞成分的單克隆細胞株。

要想對于骨肉瘤進行系統(tǒng)深入的研究,特別是分子水平的研究,細胞樣本的純度和可比性是關(guān)鍵。本實驗使骨肉瘤細胞由“系”到“株”的目的就是建立一株既成分單一,又具有可比性,且存在分化程度差異的惡性腫瘤細胞從原發(fā)部位經(jīng)淋巴、血液、體腔等途徑播散到其他部位的過程為腫瘤的遷移,這是其區(qū)別于正常細胞的生物學特征之一。而根據(jù)骨肉瘤大體形態(tài)結(jié)合成骨分化標志的表達對骨肉瘤的分化程度進行區(qū)分,進一步對其惡性程度進行早期診斷是確實而有效的辦法。

[1]Barrandon Y,Green H.Cell size as a determinant of the clone-forming ability of human keratinocytes[J].Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:5390.

[2]Jones PH,Watt FM.Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression[J].Cell,1993,73:713.

[3]TomitasN,J iangW,Hibshoosh H,et al.Isolation and characterizationof a highly malignant variant of the SW480 human colon cancer cellline[J].Cancer Res,1999,52(24):6840.

[4]張 巖,姜 侃,馮爾宥,夏仁云.高 低不同分化特性人成骨肉瘤MG-63克隆細胞株的建立[J].中國矯形外科雜志,2005,13(13).

[5]石曉兵,陳安民.不同轉(zhuǎn)移特性人成骨肉瘤MG-63細胞亞系的建立及特征[J].中國矯形外科雜志,2004,12(21):1675.

[6]Parker,Gibbs C,Kukekov VG,et al.Stem like cells in bone sarcomas:implications for tumorigenesis[J].Neoplasia,2005,11(7):9672.