李錦宏,萬海珍,劉鐵牛

(解放軍第303醫(yī)院 檢驗(yàn)科,廣西 南寧530021)

異煙肼(INH)作為最主要的一線抗結(jié)核藥物之一,對其耐藥性的研究日益受到重視。國外也有報(bào)道認(rèn)為結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的產(chǎn)生是過氧化氫酶-過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關(guān),與inhA基因突變也有相關(guān)性[1]。我們采用PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)方法檢測了95株肺結(jié)核病人痰標(biāo)本臨床分離株,并對47例結(jié)核病人痰標(biāo)本直接進(jìn)行KatG基因、inhA基因突變檢測,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料95株結(jié)核分支桿菌臨床分離株和47例肺結(jié)核病人涂陽痰標(biāo)本。95株臨床分離株按結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)規(guī)程進(jìn)行菌種鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)為結(jié)核分支桿菌,其中51株對異煙肼耐藥,44例對異煙肼敏感。47例肺結(jié)核病人涂陽痰標(biāo)本根據(jù)臨床癥狀、涂片結(jié)果、胸部X線和培養(yǎng)結(jié)果確診,其中18例對異煙肼耐藥,29例對異煙肼敏感。

1.2方法

1.2.1DNA的提取:用傳統(tǒng)酚/氯仿抽提法提取標(biāo)本中DNA[2]。

1.2.2PCR 擴(kuò)增:采用25 μ l反應(yīng)體系,4×dNTPs終濃度為0.2 mmol/l,引物終濃度為0.2 μ mol/L,擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性1 min,61℃退火1 min,72℃延伸1 min,循環(huán)30次,最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測rPOB出現(xiàn)258 bp條帶、KatG出現(xiàn)282 bp條帶、rpsL出現(xiàn)267 bp條帶即為擴(kuò)增陽性。

1.2.3SSCP銀染:PCR擴(kuò)增陽性的標(biāo)本進(jìn)行SSCP檢測,擴(kuò)增產(chǎn)物加等量甲酰胺變性液95℃變性10 min,立即冰浴5 min,在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳,條件為6℃100V 電壓,電泳約2-3小時(shí),電泳結(jié)束后.取凝膠板經(jīng)硝酸銀染色,觀察結(jié)果并照相。

2 結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增,以結(jié)核分支桿菌H37RV為對照,44株藥物敏感株、51株耐INH分離株KatG、inhA基因擴(kuò)增均為陽性;47例耐INH肺結(jié)核病人痰標(biāo)本中,KatG基因44例擴(kuò)增陽性、inhA基因40例擴(kuò)增陽性(見表1)。

2.2應(yīng)用PCR-SSCP技術(shù)檢測KatG、inhA基因突變結(jié)果(見表1、2)。

表1 對47例肺結(jié)核病人痰標(biāo)本的檢測結(jié)果

表2 對95例臨床分離株的檢測結(jié)果

44株藥物敏感株的KatG、inhA基因突變率分別為4.5%、0。51株耐INH分離株中,31株KatG基因發(fā)生突變,突變率為60.8%;3株inhA基因發(fā)生突變,突變率為5.9%。耐INH肺結(jié)核病人痰標(biāo)本中,基因突變檢測率分別為47.7%、7.5%。

3 討論

近年來,耐藥結(jié)核病病情逐年上升,特別是對異煙肼和利福平耐藥的耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的增多,是影響結(jié)核病化療效果的主要原因。因此,建立一種新的快速,有效的藥敏試驗(yàn)方法對結(jié)核病的早期治療具有重要的意義。有研究表明[3]結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的產(chǎn)生與過氧化氫酶一過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關(guān),與inhA基因也有相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)PCR-SSCP方法得出耐異煙肼時(shí),KatG基因突變率為60.8%、inhA基因突變率為5.9%。表明KatG基因突變是結(jié)核分支桿菌耐異煙肼臨床分離株主要的基因突變類型。說明KatG在INH耐藥中起主導(dǎo)作用,但某些菌株的耐INH形成可能與KatG無關(guān)。KatG基因突變是INH耐藥性的重要分子機(jī)制,inhA基因與INH耐藥性有相關(guān)性。

由于有90-95%的耐利福平株同時(shí)也耐INH,這樣單獨(dú)進(jìn)行INH的藥物敏感性分析可初步制定細(xì)菌的耐藥譜。同時(shí)檢測了47例耐INH肺結(jié)核病人的痰標(biāo)本,44例擴(kuò)增陽性的耐INH痰本KatG基因突變率為47.7%、inhA基因突變率為7.5%,說明應(yīng)用PCR和PCT-SSCP技術(shù)可以簡便、快速直接檢測未經(jīng)培養(yǎng)的痰標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌KatG基因突變,為臨床檢測結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的耐藥性提供了初步依據(jù)。

[1]Pretorius QS,Van Helden PD,Strge1 F et al.Matation in Katg gene,Antimicrob[J].Agents Chenother,1995,39(10):2276.

[2]張小剛,何秀云.結(jié)核分支桿菌耐鏈霉素耐藥基因的檢測[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2001,17(10):1006-1007.

[3]張宗德,馬 與,程紹基,等.異煙肼耐藥與結(jié)核分支桿菌KatG基因突變的研究[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,1996,19(6):346-349.