王麗娜,陳 偉,甘義明,劉艷豐

(1.吉林大學第一醫(yī)院婦產科,吉林 長春130021;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科,吉林長春 130031;3.吉林大學附屬醫(yī)院放射線科,吉林 長春130021)

目前研究已經證實高危型人乳頭瘤病毒的感染是宮頸癌的病因,宮頸癌組織中99%可檢測到HPV?，F(xiàn)已經發(fā)現(xiàn)的HPV大約200余型,根據(jù)地域的不同,各型的發(fā)病率也不同。在全世界范圍內以16型最常見,在我國和一些亞洲和非洲國家,58型居于第二位[1,2]。鑒于我國58型HPV的高發(fā)的情況,我們開展了HPV58相關宮頸癌疫苗的基礎研究工作,應用真核細胞大量表達并純化了HPV衣殼蛋白(L1L2蛋白),組裝成病毒相似顆粒,并對其免疫原性進行研究。

1 材料和方法

1.1 試劑及標本的來源

pUC19-HPV58(含全長的 HPV58基因)、由日本國立感染癥研究所神田惠贈。pGEM-T easy質粒購自Promega公司。PCR試劑盒、限制性核酸內切酶 NotI、KpnI、XhoI購自TAKAR A公司。連接酶、BAP75、HPV16L1抗體購自 Pharmingen公司,羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶、福氏佐劑、pFastBac-1、pFastBac Duel質粒,轉染用試劑 Effectene購自QIAGEN公司。引物由日立計測器服務株氏會社訂制。DH10Bac菌株、Sf9細胞及培養(yǎng)液SFII900、兔抗 hpv L2多肽抗體(108-120aa)購自GIBCO Invitrogen corporation公司

1.2 PCR擴增58L1,58L2片段克隆測序

以pUC19-HPV58為模板,L1的上游引物 5’-ATGTCCGTGTGGCGGCCTAGT,下游引 物 3’-TTATTTTTTAACCTTTTTGCG。L2的上游引物 5’-CTCGAGATG AGACAAACGGTCTACA,下游引物 3’-GGTACCCTAGGCCGCCACACGGACATC。PCR 反應體系:模板 100 ng,ExTaq0.25,引 物各 0.5 mM,dNTP5 μ l,10 ×Buffer 5μ l,加蒸餾水至 50μ l。反應條件:94℃ 3min,進入循環(huán)94℃30 s,55℃30 s,72℃2 min,循環(huán)25次,72℃延伸7 min。反應產物8%瓊脂糖凝膠電泳后回收L1的1574bp片段和L2的1 418 bp片段,過柱純化后,連接入pGEM T easy質粒構建成pGEM T easy-58L1和pGEM T easy-58L2質粒,并轉入DH5α大腸桿菌中擴增,提取質粒用Genetic Analyzer 310測序儀(ABI PRISM公司)測序。挑取正確的克隆擴增DNA進行下一步實驗。

1.3 構建pFast Bac-1-58L1和pFast Bac duel-58L1L2

1.3.1pFast Bac-1-58L1的構建 將pFast Bac-1用NotⅠ酶切后,末端去磷酸化。pGEM T easy-58L1NotI酶切后接入pFast Bac-1中構建成pFast Bac-1-58L1重組質粒。PvuII和HindⅢ雙酶切篩選方向正確插入的重組質粒。

1.3.2pFast Bac duel-58L1L2構建 pFast Bac duel質粒和pGEM T easy-58L2分別用KpnI和XhoⅠ雙酶切后,pFast Bac duel載體側去磷酸化,插入KpnI-58L2-XhoⅠ片段。酶切篩選正確插入片段的重組質粒pFast Bac duel-58L2,此質粒用NotI酶切去磷酸化后插入58L1片段,同樣酶切鑒定插入方向。構建成pFast Bac duel-58L1L2重組質粒。

1.4 重組桿狀病毒載體的構建

pFast Bac-1-58L1和 pFast Bac duel-58L1L2分別轉導入DH10Bac大腸桿菌中,使其與大腸桿菌中的桿狀病毒DNA(Bacmid)發(fā)生同源重組。PCR鑒定篩選發(fā)生同源重組的桿狀病毒載體Bacmid-58L1,Bacmid-58L1L2。

1.5 昆蟲細胞的轉染和病毒液的制備

各10 ng的Bacmid-58L1,Bacmid-58L1L2轉染 sf9昆蟲細胞,轉染方法按試劑盒所示操作。27C培養(yǎng)三日后回收上清液,即病毒液P1,再以P1感染sf9制備病毒液P2。

1.6 HPV58L1和HPV58L1L2蛋白的大量表達純化及檢測

用病毒液P2感染sf9細胞。27℃孵育3日后回收細胞,3 000 rpm離心5 min。沉淀細胞PBS緩沖液洗滌2次,加5%NP-40的PBS重旋細胞后置冰中10 min。4℃,5 000 rpm離心30 min。棄上清,沉淀細胞核加1.28 g/ml的CsCl-PBS,超聲破碎。31 000 rpm,20℃,離心24 h。96孔板分段收集離心后的液體。各取 1 μ l上樣于10%SDS-PAGE膠,電泳后進行考馬斯亮蘭染色和western blot。選取L蛋白濃度最高處的收集液,在PBS緩沖液中透析過夜。5/45%的蔗糖密度梯度離心,35 000 rpm4C,2.5 h。96孔板分段收集。再次SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色,鑒定蛋白是否純化。Westernblot一抗為用小鼠制備的hpv16L1單抗,1∶5 000稀釋。

1.7 電鏡觀察純化后的兩種蛋白是否形成病毒相似顆粒

1.8 制備抗體

取純化的蛋白L1,L1L2。各75 μ g與等體積的佐劑混勻后,生理鹽水稀釋至250 μ l,6周齡的 Balb/C小鼠背部皮下注射,一周后加強免疫一次。五周后再次加強注射一次,加強免疫劑量減半,方法同前。首次免疫后六周處死小鼠,腹主靜脈取血。離心制成抗血清。

1.9 血清中抗體的檢測

取純化的58L1L2蛋白,及純化后的16L1L2共表達的蛋白(近藤博士贈送)進行SDS-PAGE電泳,以上述制備的抗血清(1∶2 000稀釋)為一抗進行 Western blot分析,按照 ELC試劑盒操作,STOM顯影。

2 結果

2.1 HPV58衣殼蛋白與桿狀病毒重組并在昆蟲細胞中高效表達

將感染58L1和L1L2重組桿狀病毒的SF9細胞破壞細胞核后進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色均在55 kD處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶,與L1蛋白大小一致。但在70KD處(相當于 L2蛋白大小)無明顯條帶出現(xiàn)(結果未附)。以HPV58L1抗體為一抗的Western-blot結果顯示兩種重組病毒感染的細胞均在55KD處出現(xiàn)特異性條帶(圖1A)。而陰性對照組(空載體Bacmid感染的Sf9細胞)無此蛋白表達。另外,以HPVL2抗體為一抗的Western-blot結果顯示 Bacmid-L1L2感染的細胞在70 kD處出現(xiàn)特異性條帶(圖1B)。

圖1 重組桿狀病毒感染的Sf9細胞Western-blot分析

2.2 單獨表達的58型L1及共表達的L1L2蛋白均能自主組裝成病毒相似顆粒

兩種純化的蛋白透析后,分別以PBS稀釋后電鏡下觀察病毒顆粒形成情況。單獨表達的L1蛋白及L1L2共表達的蛋白均能形成病毒相似顆粒,大小和形態(tài)與野生型的病毒顆粒難以分辨。如圖2所示。

2.3 用小鼠制備的抗血清中抗體的分析

純化后的HPV58L1-VLP、HPV58L1L2-VLP進行SDS-PAGE電泳,用純化后的VLP免疫小鼠所獲得的抗血清HPV58L1 Mb、HPV58L1L2-Mb做一抗進行 western-blot分析,結果如圖3A、3B所示,兩組血清做一抗的電泳均可在55 kD處出現(xiàn)特異性強雜交信號,相當于L1蛋白大小。而HPV58L1L2-Mb做一抗的結果中HPV58L1L2-VLP電泳在70kD處(相當于L2蛋白大小)未出現(xiàn)期望的條帶。

圖3 以免疫小鼠制備的抗血清為一抗的Western-blot

3 討論

宮頸癌占女性惡性腫瘤的12%,成為世界范圍的第二位的婦科腫瘤[3]。其中接近80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。人們已經認識到HPV感染是宮頸癌的首要病因,因此針對HPV感染的宮頸癌疫苗的研制成為國內外學者研究的焦點。國外學者研究表明單獨表達的 hpv16L1或共表達的hpv16L1L2自主組裝成的VLP具有與野生病毒相同的抗原表位,以此免疫小鼠,產生的抗體具有中和活性,能抑制HPV的感染。而且這種VLP只是空的蛋白衣殼,不含病毒的原癌基因,不會人為的導致癌變,安全有效,是很有前景的宮頸癌的預防疫苗。在美國上市的HPV預防性疫苗是GSK公司開發(fā)的16/18二價疫苗,和Merck公司開發(fā)的6/11/18/16四價疫苗,臨床研究證實注射后產生的抗體效價比自然感染后產生的抗體效價高50倍。HPV16單價的疫苗對3,4年內宮頸上皮內瘤樣病變的發(fā)生起到100%的保護[4]。采用16/18雙價疫苗對4,5年內宮頸上皮內瘤樣病變的發(fā)生起到100%的保護[5]。

目前已經發(fā)現(xiàn)的HPV病毒有200余亞型,與宮頸癌密切相關的高危型也有18種,迄今還沒有一種疫苗能夠抵抗所有型別的HPV感染。在我國和一些亞洲國家58亞型的感染是僅此于16亞型的,為開發(fā)適合于我國婦女的宮頸癌疫苗,我們對HPV58進行了細致的研究,應用桿狀病毒昆蟲表達系統(tǒng)進行了hpv58型衣殼蛋白L1單獨表達以及L1L2的共表達。結果證明了其與hpv16型相同,大量表達純化的58型hpvL1蛋白能單獨自主組裝成VLPs。與L2共表達的L1蛋白亦自主組裝成VLPs。電鏡下其形態(tài)與野生型hpv完全相同。這種hpv58特異的VLPs的制備,對于我國宮頸癌的預防性疫苗的開發(fā)具有重要的意義。

此實驗中應用的目的基因片段-58L1序列是從L1的第二個ATG開始的,去掉了N-末端的26個氨基酸。實驗中曾應用完整的L1序列進行實驗,但表達的L1蛋白量少,且很難得到純化(結果未附)。有可能是由于hpv58L1的N末端的幾個氨基酸結構特殊,與細胞中的其他蛋白結合,影響L1的純化。實驗表明去除N末端的幾個氨基酸后并不影響所表達蛋白的活性。仍然具有自主裝配的活性[6]。(L1抗原決定簇被中和抗體識別具有構象依賴,變性L1不會誘導中和抗體產生,因此保持野生病毒的空間構象對預防性疫苗非常關鍵,我們純化后的蛋白經電鏡檢測證實L1單獨以及L1/L2蛋白聯(lián)合均能自主包裝成VLPs,與野生型病毒顆粒外觀一致。

文獻報道野生型病毒中L1與L2的表達量為30∶1,L2蛋白的表達量雖然少,但也具備中和表位,研究表明,L2在病毒選擇性包裝乳頭瘤病毒DNA上和增加乳頭瘤病毒的傳染性方面發(fā)揮作用。L2可能還有促進病毒顆粒的裝配,抵消E2的轉錄和復制的活性[7]。而且實驗證明在酸性溶液中L1/L2組裝成的VLP比L1單獨組裝的更穩(wěn)定。關于5量體的衣殼粒的具體結合方式尚未解明,但衣殼粒之間相互結合形成衣殼時,必須有2或3個二硫鍵[8]。

L2的108-120氨基酸是抗原決定簇,針對這個抗原決定簇的抗體具有中和活性。表達L2-GFP-組氨酸的融合蛋白與多種細胞共同孵育,隨時間的推移,融合蛋白首先黏附在細胞膜表面,繼之進入細胞內,由此推測L2蛋白可能在病毒感染上發(fā)揮重要作用,因此誘導針對L2的抗體也很重要,我們實驗中應用的L2抗體是用兔制備的抗hpv L2多肽抗體(108-120aa),108-120多肽是L2蛋白的中和抗原決定簇所在部位,本次實驗Western-blot結果顯示L1L2共表達的產物在70KD處出現(xiàn)淡淡的條帶,說明自主裝配的L1L2VLP可能亦具備L2的中和表位。能增強VLP的免疫反應性。我們用所表達純化的蛋白分別免疫小鼠后均誘導出了高滴度的L1特異性抗體,但與L1共同表達的L2沒有產生相應的抗體?？赡苁怯捎贚2的表達量過少,不足以產生能檢測得到的抗體。今后的目標是如何能增強L2蛋白的表達量,而不影響VLP的形成。制作出能誘導L1,L2中和抗體的疫苗。

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