趙 巖,林風武,李 才,王麗娟,巴麗薇

(1.吉林大學第二臨床醫(yī)院內分泌科,吉林長春130041;2.吉林大學中日聯誼醫(yī)院胸外科;3.吉林大學藥學院實驗藥理與毒理學教研室)

尾加壓素Ⅱ(UⅡ)是新近發(fā)現的一種在生物界廣泛存在的生長抑素樣環(huán)狀結構神經肽,是一種自分泌/旁分泌生長因子。研究發(fā)現,UⅡ對腎小球系膜細胞(MC)具有促絲裂作用[1],可能在糖尿病腎病(DN)發(fā)病機制中具有一定作用。本實驗觀察了UⅡ對體外高糖培養(yǎng)的MC纖連蛋白(FN)、IV型膠原(Col IV)mRNA表達的影響,旨在為進一步探討UⅡ在DN發(fā)病中的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠腎小球系膜細胞系購自上海坤肯生物化工有限公司;尾加壓素Ⅱ購自美國Sigma公司;山羊抗大鼠UⅡ多克隆抗體購自Santa Cruz公司;PCR引物由上海生工生物技術公司合成;英國Techne TC-312 PCR擴增儀;德國Hermle/2K38離心機。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和干預 選用傳代至5-10代生長良好的MC,經0.25%胰蛋白酶消化,制成單個細胞懸液,以每孔1×104的細胞數接種于12孔培養(yǎng)板中。當生長至覆蓋瓶底面積70%時,更換無血清DMEM培養(yǎng)液,培養(yǎng)24 h后按下述干預條件進行分組:①對照組;②UⅡ組:終濃度10-8mol/L;③UⅡ+Ca2+通道阻斷藥尼卡地平組(尼卡地平,10-5mol/L,提前5 min加入);④UⅡ+Ca2+螯合劑 EDTA組(EDTA 2×10-3mol/L,提前30 min加入);⑤UⅡ+UⅡ抗體組(抗UⅡ抗體10-5mol/L,提前60 min加入)。每孔設6個復孔,培養(yǎng)24 h。

1.2.2RT-PCR檢測FN、ColⅣmRNA表達水平

1.2.2.1細胞總RNA提取及RNA純度測定 上述各組細胞棄上清,PBS沖洗后加入Trizol提取細胞總RNA。紫外分光光度計測260 nm/280 nm處紫外吸收值,重復三次取平均值。結果各組A260/A280在1.8-2.0之間,說明所提取RNA純度高。

1.2.2.2逆轉錄反應 采用30 μ l反應體系。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3引物合成 根據基因庫檢索大鼠FN、ColⅣ及內參對照物GAPDH mRNA序列,應用引物設計 軟件設計引物,由上海生工生物技術公司合成。

Primer sequences for PCR products

1.2.2.4聚合酶鏈反應(PCR)采用25 μ l反應體系,退火溫度因引物不同而不同,30個循環(huán)后,72℃延伸10 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.5PCR產物的檢測和分析 各泳道以PCR產物:上樣緩沖液為5∶1(μ l)上樣,恒壓85 V 電泳。電泳結果在紫外燈下照相,用Tanon GIS-1000凝膠圖像處理系統(tǒng)進行數據分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

與對照組比較,UⅡ組MC FN、ColⅣmRNA表達明顯升高(P＜0.05);UⅡ+尼卡地平組、UⅡ+EDTA組及UⅡ+抗UⅡ抗體組MC FN、ColⅣmRNA表達明顯低于UⅡ組(P＜0.05),UⅡ+抗UⅡ抗體組最為明顯,比對照組稍高,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表 1、圖 1。

表1 UⅡ對 MC FN、ColⅣmRNA表達的影響

3 討論

DN的早期病理改變?yōu)槟I小球肥大、增生和細胞外基質(ECM)積聚。MC是腎小球的主要固有細胞,是ECM合成的主要場所,FN和Col IV是ECM的主要成分,反映ECM的代謝水平[2]。

圖1 UⅡ對大鼠MC FN、ColⅣmRNA表達的影響

Watamabe等[3]研究發(fā)現,UⅡ能以自分泌/旁分泌方式作用于MC,對MC具有促增殖作用。大量體內外研究證實,系膜細胞增生與ECM增多之間有密切聯系,二者在 DN發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[4-6]。但UⅡ與ECM間關系目前還不清楚。

目前認為,UⅡ與其特異性受體GPR14結合,引起Ca2+內流,細胞內Ca2+升高,是引發(fā)其生物學作用的根本原因[7]。我們以10-8mol/LUⅡ[8]作為試驗組,以UⅡ+Ca2+通道阻斷劑尼卡地平、UⅡ+Ca2+螯合劑EDTA及UⅡ+抗UⅡ抗體作為UⅡ作用阻斷組,觀察了各組MC FN、ColⅣmRNA表達情況。結果顯示,UⅡ組MC FN、ColⅣmRNA表達水平較對照組明顯升高(P＜0.05),說明UⅡ能增加MC FN、ColⅣmRNA表達。各UⅡ阻斷組MC FN、ColⅣmRNA表達水平明顯低于UⅡ組(P＜0.05),且與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),說明這種促MC FN、ColⅣmRNA表達作用是UⅡ所特異的,且與Ca2+有關。這是UII直接作用還是間接作用的結果,還有待于進一步探討。這一結果可能成為UⅡ參與DN發(fā)生發(fā)展的又一實驗依據。

[1]張勇剛,陳亞紅,馬春艷,等.尾加壓素Ⅱ的促絲裂作用[J].中國動脈硬化雜志,2001,9(1):14.

[2]Adler SG,Feld S,StrikerG,et al.Glomerular type IV collagen in patients with diabetic nephropathy with and without additional glomerular disease[J].Kindney Int,2000,57(5):2084.

[3]Watamabe T,Pakala R,Katagiri T,et al.Synergistic effect of urotensinⅡwith mildly oxidired LDL on DNA synthesis in vascular smooth muscle cells[J].Circulation,2001,104:16.

[4]Sharma K,Ziyadeh FN.The emerging role of transforming growth factorβin kidney diseases[J].Am J Physiol,1994,35:829.

[5]Mason RM,Wahab NA.Extracellular matrix metabolism in diabetic nephropathy[J].Am Soc Nephrol,2003,14:1358.

[6]Fogo AB.Glomerular Hypertension,abnormal glomerular growth,and progression of renal diseases[J].Kidney Int,2000,75:S15.

[7]Ames RS,Sarau HM,Chambers JK,et al.Human urotensinⅡis a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14[J].Nature,1999,401:282.

[8]趙 巖,李 才,林風武,等.尾加壓素II對體外高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響[J].吉林大學學報(醫(yī)學版),2008,34(6):954-958.