韓向北,許 多,郭亞雄,李德龍,程 宏,朱彤彤#,張婉嫻*,趙麗晶,趙麗娟*

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,吉林長(zhǎng)春130021;2.吉林省人民醫(yī)院)

郁金作為傳統(tǒng)中草藥,具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、作用多樣且療效確切等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)代研究表明,郁金具有調(diào)節(jié)免疫、抑制中樞神經(jīng)、抗自由基損傷、改善血液流變學(xué)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,抗肝纖維化等作用[1-3]。單味郁金水煎劑對(duì)受損肝細(xì)胞凋亡及其機(jī)制的研究卻少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)肝細(xì)胞Bcl-2、Bax基因及蛋白水平的表達(dá)變化,探討單味郁金水煎劑對(duì)CCl4急性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ICR小鼠,體重18-22 g,雌雄各半,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥物與主要試劑郁金購(gòu)于吉林大藥房;甘利欣注射液(連云港正大天晴制藥有限公司,批號(hào)20040825)實(shí)驗(yàn)時(shí)用10%葡萄糖配制;四氯化碳(武漢市江北化學(xué)試劑廠,批號(hào)20021112);TUNUL試劑盒、Trizol購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于MBI公司;bcl-2、bax及GAPDH的PCR引物由上海生工生物科技有限公司合成?？贵w購(gòu)自美國(guó)san-ta cruz公司。

1.3動(dòng)物分組與給藥ICR小鼠48只,雌雄各半,隨機(jī)分為6組,每組8只:陽(yáng)性藥組(甘利欣22.5 mg·kg-1),郁金高 、中 、低劑量組(12g·kg-1、6 g·kg-1、3 g·kg-1),空白對(duì)照組及模型組(等體積蒸餾水),灌胃給藥,1次/d,連續(xù)給藥7 d。第7 d給藥1 h后造模。

1.4模型制備參照文獻(xiàn)[4],各組(空白對(duì)照組除外)小鼠以0.2%CCl4橄欖油溶液10ml·kg-1腹腔注射,禁食不禁水24 h,稱重后眼球取血處死,快速取出肝臟。

1.5血清生化指標(biāo)檢測(cè)按試劑盒方法(賴氏法)測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT),門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的含量。

1.6TUNUL染色觀察凋亡細(xì)胞參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行TUNEL染色,陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光,在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.7RT-PCR法檢測(cè)Bcl-2、bax的轉(zhuǎn)錄情況遵循PCR引物設(shè)計(jì)原則,根據(jù)GeneBank鼠基因cDNA序列,分別設(shè)計(jì)Bcl-2、bax及Gapdh引物。序列見表1,提取肝組織總RN A,瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并根據(jù)A260值計(jì)算RNA濃度。取4 μ g總RNA行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)體系中加1 μ l隨機(jī)引物,加雙蒸水定容至12 μ l,70℃溫育 5 min,冰浴后加入 10 μ MdNTP Mix 2 μ l,5×緩沖液 4 μ l,RNA 酶抑制劑(20 U)1 μ l,25℃溫育5 min,加入逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U)1 μ l,終體系為 20 μ l,25℃、10 min,42℃、60 min,72℃、10 min。而后進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)體系為:cDNA稀釋液1 μ l,20×SYBR PCR 主反應(yīng)液 9 μ l;上下游引物各 1 μ l(0.25 μ M);去離子水 13 μ l;總體積 25 μ l;反應(yīng)條件為:94℃變性 5 min,94℃變性 30 s,55-57℃30 s,72℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min。以Gapdh作為內(nèi)參照。每個(gè)樣本做三個(gè)副管。隨機(jī)Rotor-Gene軟件分析,雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算基因表達(dá)量。

Tab.1 Bcl-2、bax and Gapdh

1.8免疫組織化學(xué)染色觀察bcl-2及bax蛋白表達(dá)變化用一抗檢測(cè)肝組織細(xì)胞內(nèi)的抗原,再用顯色物質(zhì)標(biāo)記的二抗檢測(cè)一抗,放大檢測(cè)信號(hào),陽(yáng)性細(xì)胞被染為棕色。肝組織切片脫蠟后水洗,蒸餾水洗,PBS洗。3%H2O210 min后自來(lái)水充分水洗,蒸餾水洗,PBS洗。熱抗原修復(fù)或消化將切片置入抗原修復(fù)液中,用微波爐加熱至沸騰10-20 s。10 min后再加熱一次。再10 min后取出冷卻,至室溫后蒸餾水洗,PBS充分洗。加正常血清封閉20分鐘棄血清后,直接加一抗:兔抗鼠(bcl-2和bax)抗體稀釋比例為1∶50,37℃孵育 1 h。室溫1 h,PBS充分洗。加(羊抗兔)通用型IgG抗體(Fab段)IgG/HRP,室溫30 min。PBS充分洗。滴加DAB顯色劑,在顯微鏡下觀察直至出現(xiàn)棕色細(xì)胞。自來(lái)水充分洗,蘇木精復(fù)染3 min。鹽酸乙醇分化2 s,自來(lái)水充分洗。無(wú)水乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固,晾干觀察。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件作 t檢驗(yàn)和方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1血清ALT、AST的檢測(cè)結(jié)果與空白對(duì)照組比較模型組血清ALT、AST水平顯著增高(P＜0.01),表明急性肝損傷模型成立。與模型組相比,郁金各劑量組血清ALT、AST水平均明顯降低,且呈劑量依賴性,統(tǒng)計(jì)學(xué)比較差異顯著(P＜0.05,P＜0.01),說(shuō)明郁金可明顯減輕CCl4所致小鼠急性肝損傷,詳見表2。

表2 郁金對(duì)CCl4急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(s,n=8)

表2 郁金對(duì)CCl4急性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(s,n=8)

與對(duì)照組比較**P＜0.01;與模型組比較 ▲P＜0.05,▲▲P＜0.01

組別 劑量 ALT(U·L-1)AST(U·L-1)空白對(duì)照組 17.75±4.57 34.87±7.99模型組 75.27±10.31** 99.33±26.99**陽(yáng)性藥組 22.5 mg·kg-1 28.08±5.07▲▲ 44.87±12.30▲▲郁金大劑量 12 g·kg-1 36.11±6.52▲▲ 50.21±14.25▲▲郁金中劑量 6 g·kg-1 38.65±8.07▲▲ 52.23±13.66▲▲郁金小劑量 3 g·kg-1 48.13±17.91▲ 65.12±13.11▲

2.2TUNUL染色結(jié)果如圖1所示:與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠肝組織TUNUL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多;而郁金給藥組與模型組相比肝組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)卻明顯減少。說(shuō)明單味郁金水煎劑可阻止肝細(xì)胞凋亡,減輕肝損傷。

圖1 TUNUL染色結(jié)果(40×)

2.3Bcl-2及bax基因轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果表明:與空白對(duì)照組比較,模型組Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄水平明顯降低、bax基因轉(zhuǎn)錄水平明顯增高、Bcl-2/Bax比值下降;與模型組相比,郁金中、低劑量組Bcl-2基因表達(dá)明顯上調(diào)、而bax基因表達(dá)明顯下調(diào)、Bcl-2/Bax比值增大。各組間比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.05),詳見表3和圖2。

表3 Bcl-2及bax基因表達(dá)情況(s,n=3)

表3 Bcl-2及bax基因表達(dá)情況(s,n=3)

*P＜0.05**P＜0.01,與空白對(duì)照組比較;▲P＜0.05▲▲P＜0.01,與模型組比較

組別 Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax空白對(duì)照組 0.589±0.049 0.377±0.103 0.335±0.901模型組 0.234±0.046**1.656±0.052**0.024±0.077*郁金中劑量組 0.519±0.100▲ 1.389±0.072▲ 0.057±0.195▲郁金低劑量組 0.526±0.096▲1.292±0.045▲▲0.066±0.226▲

圖2 Bcl-2、bax基因表達(dá)情況

2.4Bcl-2及bax蛋白免疫組化染色結(jié)果與空白對(duì)照組比較Bcl-2蛋白在受損肝組織中表達(dá)明顯減弱(胞漿呈棕黃染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少);而郁金中、低劑量組肝細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比模型組明顯增多,詳見圖4。與空白對(duì)照組相比bax蛋白在受損肝組織中表達(dá)增強(qiáng)。而與模型組比較,郁金中、低劑量組Bax蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)卻明顯減少,這與上述RT-PCR結(jié)果相一致,詳見圖3、圖4。

3 討論

本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明,單味郁金水煎劑具有明顯改善肝功能;減輕肝組織炎癥反應(yīng)及肝細(xì)胞變性、死亡程度;降低肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng);調(diào)節(jié)肝細(xì)胞免疫平衡等作用[4]。為了觀察單味郁金水煎劑是否具有良好的抗肝細(xì)胞凋亡作用并探究其機(jī)制,特設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)。

圖3 Bcl-2免疫組化染色結(jié)果(40×)

本研究仍采用CCL4復(fù)制小鼠急性肝損傷病理模型。CCl4進(jìn)入機(jī)體后可引發(fā)自由基產(chǎn)生增多而清除不足。自由基對(duì)肝細(xì)胞發(fā)生初步攻擊的同時(shí)又可激活肝枯否氏細(xì)胞(Kupferps cells),使其釋放細(xì)胞因子并進(jìn)一步活化中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞,通過(guò)一系列及聯(lián)反應(yīng)活化細(xì)胞的防御機(jī)制,這種防御反應(yīng)被不斷放大,就會(huì)出現(xiàn)肝細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、粒細(xì)胞浸潤(rùn)等肝組織損傷[5,6]。

圖4 Bax免疫組化染色結(jié)果(40×)

肝細(xì)胞損傷是一種由多因素介導(dǎo)的復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,涉及多種學(xué)說(shuō)和機(jī)制,其中肝細(xì)胞凋亡是肝損傷的一個(gè)基本特征。然而,在所有的凋亡途徑中,線粒體似乎是肝細(xì)胞凋亡的中心執(zhí)行者[7]。線粒體途徑主要由Bcl-2家族蛋白調(diào)控,其中Bcl-2、Bax為重要的凋亡調(diào)控基因。Bcl-2為凋亡抑制基因,主要通過(guò)防止線粒體釋放凋亡因子來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。bax是一種與Bcl-2相關(guān)的蛋白,其功能與bcl-2相反。Bcl-2家族成員的功能也包括它們形成同二聚體或異二聚體的能力,當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因子刺激后是否存活取決于bcl-2/bax的比率,當(dāng)bax增加時(shí),形成bax-bax同二聚體,加速細(xì)胞凋亡;當(dāng)bcl-2表達(dá)增強(qiáng)時(shí),形成bcl-2-bax異二聚體,抑制bax-bax同二聚體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)TUNEL結(jié)果顯示:郁金給藥組與模型組相比肝組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。說(shuō)明單味郁金水煎劑可阻止肝細(xì)胞凋亡,減輕肝損傷;RT-PCR及免疫組化結(jié)果顯示:模型組小鼠肝組織Bcl-2基因與蛋白表達(dá)均較空白對(duì)照組明顯下調(diào),而bax基因與蛋白表達(dá)則明顯上調(diào),結(jié)果bcl-2/bax比例降低而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡。與模型組相比郁金給藥組小鼠肝細(xì)胞bcl-2基因與蛋白表達(dá)明顯上調(diào),bax基因與蛋白表達(dá)卻明顯下調(diào),bcl-2/bax的比例增高,遏制了肝細(xì)胞凋亡。說(shuō)明單味郁金水煎劑抑制肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一可能與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞bcl-2/bax的比例有關(guān)。

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