董 雪,史艷芬,呂 慧,范洪學(xué),李榮貴*

(1.吉林大學(xué)病理生物學(xué)教育部重點實驗室,吉林長春130021;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;3.長春中醫(yī)藥大學(xué))

飲水型地砷病是由于長期攝入過量砷而引起的一種慢性蓄積性中毒性疾病,在世界范圍內(nèi)廣范存在,已成為嚴(yán)重威脅人類健康的公害病,其中大部分分布在亞洲國家,中國正是受砷中毒危害最為嚴(yán)重的國家之一[1,2]。亞砷酸鈉是飲水型地砷病中砷化物存在的主要形式,其常見臨床表現(xiàn)以肢端中小血管循環(huán)障礙及皮膚損傷為主,嚴(yán)重的患者甚至?xí)饜盒阅[瘤[3]。病理上以末梢血管退行性變及肢端壞死為主要改變。飲水型地砷病目前引起血管損傷的機制不清,本研究擬用雞胚絨毛尿囊膜血管新生模型和人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞作為實驗對象,研究砷對血管增殖效應(yīng)的體內(nèi)體外作用,以期為地砷病的血管損傷機制提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料、儀器

亞砷酸鈉(NaAsO2),購于SIGMA公司;HUV-EC(人臍靜脈內(nèi)皮細胞)由吉林大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室惠贈,(Dulbecco’s Modified Eagle Media,DMEM)培養(yǎng)基購自Gibco公司;優(yōu)級胎牛血清購自北京元亨金馬生物公司;LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;Trizol試劑盒、RT2PCR試劑盒購自Takara公司;2×SYBR GreenⅠ試劑購自ABI公司。Real time2PCR儀為美國ABI7300。受精種蛋購于龍德養(yǎng)雞場,每只55-65 g。

2 方法

2.1CAM模型的建立

CAM造模參考文獻方法[4]進行改良。雞胚 50只,在37℃、5%CO2及50%的相對濕度下孵化。

2.2向CAM加藥

用打孔機將玻璃纖維濾紙制成直徑3 mm的小圓片,濕熱滅菌。 設(shè) 6 個給藥組(0.033、0.33、3.3、0.1、1、10 μ mol/L)并設(shè)PBS陰性對照組。雞胚孵化3天后照蛋檢查血管網(wǎng)生長情況,剔除未發(fā)育的種蛋,每組5只。在超凈臺內(nèi),將種蛋表面用酒精消毒后,用鑷子在蛋胚頂端小心戳一小口,然后剝?nèi)ブ車牡皻ず蜌つ?使開口約為1.5 cm×1.5 cm大小。小心地用尖手術(shù)鑷子從氣室與卵黃囊分隔處挑破氣室膜,輕輕去除上層氣室薄膜,暴露下層的CAM 膜。將吸附10μ l藥物或等量PBS的載樣濾紙置于CAM和卵黃囊膜處血管較少的部位,然后用滅菌透明膠封口,繼續(xù)孵育24 h。觀察,計數(shù)藥膜周圍5 mm內(nèi)血管數(shù),并攝影記錄。

2.3細胞培養(yǎng)HUV-EC培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4HUV-EC增殖的檢測取指數(shù)生長期細胞,以5×103個細胞/孔接種于96孔板,100μ l/孔,加入不同濃度亞砷酸鈉(如圖2所示),作用 24小時后,每孔加入 CCK-8液10 μ l,置于37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1小時,室溫下低速振蕩5 min,靜置10分鐘,酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度,重復(fù)3次,計算抑制率。

2.5總RNA提取及RT-PCR分別按照產(chǎn)品說明書,應(yīng)用Trizol試劑提取細胞總RNA。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(具體操作步驟均按廠家產(chǎn)品說明書進行),其反應(yīng)條 件為:30℃、10 min,42℃、30 min,99℃、5 min,5℃、5 min。c-myc、c-jun采用實時定量 RT-PCR(SYBR Green法)進行。反應(yīng)程序為:50℃2分鐘;95℃10分鐘;92℃10秒,60℃30秒,共50個循環(huán)。引物由上海生工生物工程公司合成,引物序列見表1所示。

表1 實時PCR引物序列

2.6統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示,P＜0.05有顯著差異,有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1NaAsO2對CAM血管生長的影響在低于1 μ mol/L濃度范圍內(nèi),肉眼觀察可見隨亞砷酸鈉濃度增加,與對照組(0 μ mol/L)相比給藥組載體下,血管明顯生長,可見尿囊膜血管排列成車輻狀,類似樹葉的葉脈狀分布,在 0.33 μ umol/L時即有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(如圖 B所示);在高于1 μ mol/L濃度范圍內(nèi)。隨著亞砷酸鈉濃度增加,血管結(jié)構(gòu)破壞,或血管雖有一定數(shù)量,但其結(jié)構(gòu)并未形成熟血管的圓形狀態(tài),在部分給藥載體旁,沒有血管區(qū)域,當(dāng)濃度達到10μ mol/L(如圖E所示),給藥載體旁形成血管池,雞胚的發(fā)育明顯抑制,部分雞胚死亡,與對照組相比有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。

圖1 亞砷酸鈉對CAM的作用

表2 不同濃度NaAsO2對CAM血管生長的影響

3.2NaAsO2對HUV-EC增殖的抑制作用HUV-EC經(jīng)過不同濃度的亞砷酸鈉溶液孵育24小時后,用CCK-8試劑盒檢測活細胞數(shù),分析亞砷酸鈉對細胞抑制的影響。結(jié)果顯示:亞砷酸鈉對HUV-EC作用24 h時,30、40 μ mol/L實驗組細胞數(shù)與0 μ mol/L對照組相比有差異性(P＜0.05);50 μ mol/L以上的實驗組細胞數(shù)與相應(yīng)對照組相比均有顯著性差異(P＜0.01);其對細胞增殖的抑制率隨亞砷酸鈉濃度的增加而增大,有劑量-效應(yīng)關(guān)系如圖2所示。

圖2 亞砷酸鈉對HUV-EC的抑制作用

3.3NaAsO2降低HUV-EC的c-myc、c-junmRNA 應(yīng)用實時定量RT-PCR技術(shù)對HUV-ECmRNA表達水平的分析,結(jié)果顯示:經(jīng)20μ mol/L濃度亞砷酸鈉處理的HUV-EC,其 c-myc、c-jun的mRNA表達水平明顯降低。結(jié)果如圖3所示:經(jīng)過20 μ mol/L亞砷酸鈉溶液處理后,HUVECs的增殖基因mRNA表達量與對照組細胞相比分別下降了69%和19%,統(tǒng)計學(xué)上均有顯著性差異(**P＜0.01)。

圖3 亞砷酸鈉降低HUV-EC的c-myc、c-jun mRNA水平

4 討論

地砷病的發(fā)病機制目前并不十分清楚,在其疾病的發(fā)生發(fā)展過程中,常見以末梢血管退行性變及肢端壞死為主要改變。雞胚尿囊膜(CAM)血管新生模型是常用的體內(nèi)血管研究模型。在Nicole V.Soucy等人研究基礎(chǔ)上[5],本研究進一步驗證了3.3μ mol/L濃度的亞砷酸鈉對血管即有明顯的抑制作用(P＜0.05),當(dāng)濃度達到 10 μ mol/L時,給藥載體周圍已形成血管池,部分雞胚甚至死亡。本研究中又以HUV-EC為體外研究模型,研究砷對其作用。我們在較早的研究中就發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡,這在其對血管損傷進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。本實驗結(jié)果顯示亞砷酸鈉在30 μ mol/L時,就明顯抑制HUV-EC的增殖,在所用的亞砷酸鈉濃度范圍內(nèi)呈典型的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

c-myc、c-jun是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白,它與其蛋白配基(主要是Max蛋白)形成復(fù)合物后轉(zhuǎn)移并定位于胞核內(nèi),與DNA特異性的序列相結(jié)合,參與調(diào)節(jié)Cyclin、CDKs等細胞周期關(guān)鍵蛋白的表達[7],進而影響細胞生長、增殖、分化和細胞周期。提示本實驗結(jié)果:亞砷酸鈉抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖,是通過下調(diào)c-myc[8]、c-jun基因的表達,進而降低細胞周期相關(guān)蛋白的含量,影響細胞周期實現(xiàn)的。

隨著亞砷酸鈉濃度增加,CAM血管增生明顯受到抑制,HUV-EC增殖抑制率明顯升高,且 c-myc、c-jun基因表達量下降,說明砷化物是通過下調(diào)c-myc、c-jun表達來抑制血管增殖。在飲水型地砷病中內(nèi)皮細胞的增殖在維持血管完整性、血管損傷的修復(fù)過程中起到重要作用,而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞砷酸鈉對體內(nèi)血管及體外HUV-EC增殖均有抑制作用,從而提示:在地砷病的發(fā)病過程中,NaAsO2對血管增殖抑制是其致病機制之一。

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[3]Sun,G..Arsenic contamination and arsenicosis in China[J].Toxicol Appl Pharmacol,2004.198(3):p.268-71.

[4]Kirchner L M,Schmidt S P,GruberB S.Quantitation of angiogenesisinthe chick chorioallantoic membranemodel using fractal analysis[J].Microvas Res,1996,(51):

[5]Nicole V.Soucy,et al.Arsenic Stimulates Angiogenesis and Tumorigenesis In Vivo[J].Toxicological Sciences,2003.76(2):p.271.

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[7]陳 龍,陳潔萍,等.c-Myc對腫瘤細胞生長抑制基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控[J].中華腫瘤防治雜志,2006,13(22):1752.

[8]呂 慧,史艷芬,等.亞砷酸鈉對人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移、增殖的影響及其機制研究[J].江蘇醫(yī)藥雜志,2010,待發(fā).