何志紅,吳素華,蘇德華,唐,成伶俐

(1.鹽步醫(yī)院心內(nèi)科,廣東佛山528247;2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科;3.贛南師范學(xué)院體育學(xué)院)

心肌缺血再灌注(myocardial ischemia and reperfusion,MI/R)損傷是指缺血心肌組織在恢復(fù)血液灌注后發(fā)生的細(xì)胞死亡或功能降低進(jìn)一步加重。一般認(rèn)為,參與心肌缺血再灌注損傷的主要因素有氧自由基、補(bǔ)體系統(tǒng)、中性粒細(xì)胞和鈣超載。既往比較重視氧自由基、鈣超載和中性粒細(xì)胞。但近來的研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)體系統(tǒng)激活后產(chǎn)生的各種補(bǔ)體成分在心肌缺血再灌注損傷中起著相當(dāng)重要的作用。大量在體實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)抑制補(bǔ)體可以明顯減輕心肌缺血再灌注損傷。缺血和缺氧有著及其相似的病理改變和發(fā)病機(jī)制。本研究采用離體培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞建立缺氧/復(fù)氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)損傷模型,模擬在體心肌缺血再灌注損傷,應(yīng)用RNA干擾技術(shù)通過C5-siR NA特異性地抑制C5表達(dá),從而探討其對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料攜帶C5-siRNA的慢病毒(美國Santa Cruz biotechnology公司提供)。新生5 d SD大鼠【由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供,合格證號:S CXK(粵)2008-0020】。普通PCR儀:MyCycler(美國 BIORAD公司生產(chǎn))。酶標(biāo)儀 :MK3(芬蘭LAB公司提供)。細(xì)胞培養(yǎng)箱:美國THERMO公司生產(chǎn)的3110。CCK-8試劑由TONGREN公司提供。RT試劑:加拿大fermentas公司提供。

1.2方法

1.2.1心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 取5日齡Wistar大白鼠乳鼠放入0.1%新潔爾滅浸泡后用針頭固定于泡沫板上,開胸取心放入D MEM液中。剔除心臟周邊的血凝及纖維組織 ,置于 另一D MEM培養(yǎng)皿中。將心臟剪成1mm3的碎塊,用300目網(wǎng)篩研磨濾過,沖洗3 000 rpm離心取沉淀后,取0.25%胰酶0.3 g/L膠原酶3 ml 37℃消化10 min,加完全培養(yǎng)基終止消化,3 000 rpm離心取沉淀細(xì)胞用含青鏈霉素、10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基接種于100 mm的培養(yǎng)皿中,37℃、5%的CO2飽和濕度下培養(yǎng)過夜帖壁,待鋪滿90%底面積后,平均接種于6孔板中。

1.2.2心肌細(xì)胞分組造模 各組細(xì)胞均換用低氧(3%O2。、5%CO2、92%N2)培養(yǎng)箱中預(yù)飽和30 min的無血清DMEM培養(yǎng)基。H/R組、H/R+C5-siRNA組,H/R+空載體病毒組均于37℃,3%O2、5%CO2、92%N2環(huán)境中培養(yǎng)2 h后放入常氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,造成H/R損傷。其中H/R+C5-siRNA組及H/R+空載體病毒組在缺氧前2 h予C5-siR NA及空載體病毒(1.0×106IFU)。對照組于常氧環(huán)境下持續(xù)培養(yǎng)。將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為4組:對照組、H/R組、H/R+C5-siRNA組,H/R+空載體病毒組。

1.2.3心肌存活情況檢測(CKK-8 OD值)細(xì)胞對數(shù)增殖期用0.25%胰蛋白酶消化后按每孔1×104接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,平行做8孔 ,各孔按設(shè)計加入試劑后按上述條件培養(yǎng),顯微鏡下觀察各組細(xì)胞,棄上清,加入CCK-8溶液。選擇波長450 nm波長,用酶標(biāo)儀測定各孔OD值。

1.2.4C5的測定 采用RT-PCR法從RNA水平測定C5的表達(dá)量及采用Western Blot法從蛋白質(zhì)水平測定C5的含量。根據(jù) C5基因序列,引物設(shè)計序列如下:上游引物:5′-TCAAATGTGACGGTGCTAAA-3′、下游 引 5′-TCAGGTATTCTCCCACAAGC-3′;目的基因?yàn)?72 bp。 內(nèi)參GAPDH 上游引物:5′-TGCCCAGAACATCATCCCT-3′、 下 游 引 物:5′-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG-3′目的基因?yàn)?33 bp。以上引物由深圳市欣海凌生物科技有限公司合成。由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)參照Promega公司R T-PCR試劑盒說明書進(jìn)行,PCR擴(kuò)增條件的設(shè)置:94℃4分鐘;94℃20秒58℃30秒 72℃30秒循環(huán)28次,以GAPDH為內(nèi)參,分析比較各組灰度值。取擴(kuò)增終產(chǎn)物10μ l,在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠上電泳,紫外光下觀察。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以s表示。計量數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析及組間q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1C5-siRNA對心肌存活情況的影響H/R+C5-siRNA組OD值明顯高于H/R組及H/R+空載體病毒組(表1),P＜0.05,提示C5-siRNA對心肌細(xì)胞H/R損傷有保護(hù)作用。

表1 對心肌增殖情況(OD均值)的影響

2.2RT-PCR法測定C5 RNA的表達(dá)量H/R+C5-siRNA組灰度值明顯低于H/R組及H/R+空載體病毒組(圖1)。

圖1 各組C5 RNA PCR擴(kuò)增圖

2.3Wenstern Blot法測定C5蛋白的表達(dá)量H/R+C5-siRNA組灰度值明顯低于H/R組及H/R+空載體病毒組(圖2)。

圖2 各組C5蛋白的電泳圖

3 討論

自從上世紀(jì)60年代以來,國內(nèi)外大量研究證實(shí)補(bǔ)體系統(tǒng)是參與心肌缺血再灌注損傷的重要因素。Hill和Ward首次在鼠的心肌梗死區(qū)中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C3,并認(rèn)為補(bǔ)體系統(tǒng)激活是參與缺血再灌注損傷的一重要因素[16]。Yasojima等[15]對兔離體心臟進(jìn)行Langedorf灌流首次證明心肌組織自身能夠表達(dá)補(bǔ)體基因和蛋白且其對心肌缺血性損傷的程度起主要作用。這也為我們的離體研究提供了理論依據(jù)。

補(bǔ)體系統(tǒng)是由近30種可溶性蛋白質(zhì)和膜結(jié)合蛋白(C1q,C3b,iC3b,C3a,C5a,C5b-9等)組成的多分子系統(tǒng)。正常生理狀態(tài)下的補(bǔ)體系統(tǒng)是人體免疫系統(tǒng)的一個重要組成部分,其主要功能為啟動免疫反應(yīng)、溶解病原體,促進(jìn)吞噬及組織的修復(fù)等。補(bǔ)體激活級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生一系列生物活性物質(zhì),包括早期激活產(chǎn)物(如C3b、C3a和 iC3b)和晚期激活產(chǎn)物(如C5a,C5b-9)。早期產(chǎn)物如C3b主要發(fā)揮調(diào)理作用和促進(jìn)吞噬,對維持機(jī)體正常免疫功能至關(guān)重要。補(bǔ)體激活晚期產(chǎn)物如C5a的促炎作用和攻膜復(fù)合物C5b-9的溶細(xì)胞作用是加重組織損傷的關(guān)鍵因素[7,8]?；谏鲜鲈?抗補(bǔ)體治療的理想靶點(diǎn)是阻斷補(bǔ)體晚期激活產(chǎn)物的產(chǎn)生,因而在我們的研究中,選擇C5水平為阻斷位點(diǎn),依然保留C5上游的補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng),從而一方面使機(jī)體必要的免疫功能得以最大程度的保留,另一方面又可以抑制C5下游晚期產(chǎn)物C5a,C5b-9的形成,達(dá)到保護(hù)缺血組織的目的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,C5-siRNA對缺氧-復(fù)氧心肌損傷有顯著保護(hù)作用,C5-siRNA能特異性抑制C5-RNA表達(dá),進(jìn)而使C5表達(dá)量下降,抑制了C5下游級聯(lián)反應(yīng),使過敏毒素C5a和鞏膜復(fù)合物C5b-9明顯減少,從而達(dá)到減輕心肌缺血再灌注損傷的目的。我們前面在在體實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明C5-siR NA在MI/R中的保護(hù)作用,通過離體實(shí)驗(yàn)我們進(jìn)一步證實(shí)了C5-siRNA在MI/R的特殊地位,相對傳統(tǒng)的補(bǔ)體阻斷劑,它具有特異性高,穩(wěn)定性強(qiáng),高效能等優(yōu)點(diǎn)。基于上述原因及我們在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果,我們推測C5-siRNA有望成為一種理想的補(bǔ)體阻斷劑而用于臨床。

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