劉鶴松,趙自然,蘭珊珊,趙偉剛,王 芳

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 皮膚科,吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 整形外科,吉林 長春130021;3.白城市醫(yī)院 骨科,吉林 白城137000)

瘢痕疙瘩是臨床中常見的疾病,但治療是難題。人參皂甙是人參的有效化學(xué)成分,具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[1-3]。本研究是研究人參皂甙Rg3對人成纖維細(xì)胞的影響,探究應(yīng)用其治療瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的可能性。

1 材料與方法

1.1材料取我科瘢痕疙瘩患者手術(shù)切取的瘢痕組織。部位:前胸、耳垂等,年齡7-35歲,瘢痕生長時間1-3年,所有患者均無其它器質(zhì)性疾病,未做過特殊治療及激素治療,均經(jīng)過臨床和病理診斷證實。

1.1.1主要試劑 GS-Rg3由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供;DMEM培養(yǎng)基美國GIBCO公司;10%滅活小牛血清北京;培養(yǎng)板丹麥;MTT(溴化二甲噻唑二苯四氮唑藍(lán))北京;二甲基亞砜(DMSO)北京西中化工廠;碘化丙啶(PI)美國Sigma。

1.1.2主要儀器 CO2孵箱美國SHEL LAB;流式細(xì)胞儀美國BD;酶標(biāo)儀美國BIO-RAD。

1.2瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定

1.2.1原代培養(yǎng) 無菌條件下,將手術(shù)切除的瘢痕組織放入磷酸鹽平衡溶液中漂洗,用眼科剪刀和手術(shù)刀將表皮和皮下組織剔除,反復(fù)沖洗干凈后,將真皮組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊,加入2-3滴小牛血清,將組織塊均勻置于培養(yǎng)瓶壁,翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊貼壁處朝上加入6 ml含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。每毫升培養(yǎng)液中加入青霉素和鏈霉素各 100 μ,置入 37℃、5%CO2、95%空氣 、飽和濕度的孵箱,孵育12 h,組織塊充分貼壁后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使組織塊浸入培養(yǎng)基中,2-3 d換液。

1.2.2傳代培養(yǎng) 7-10 d后可見組織塊周圍有成纖維細(xì)胞生長,原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80%融合時傳代,按1∶2或1∶3的比例傳代后繼續(xù)培養(yǎng),直至細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

1.3MTT法檢測細(xì)胞的活性取第三代細(xì)胞,調(diào)整濃度為6×104/ml,以每孔50 μ l接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度GS-Rg3。放入 37℃、5%CO2孵箱內(nèi)分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,GS-Rg3終濃度為25、50、100 和 200 μ g/ml,對照組加入等量的培養(yǎng)液,每組4復(fù)孔。培養(yǎng)12 h后用培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞2次,每孔加入 MTT(5 mg/ml)10 μ l,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后,棄上清,每孔加入 DMSO 100 μ l,振搖 10 min,用Bio-RAD550型酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長下讀取A值,并計算抑制率。

1.4流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞周期

1.4.1取第三代細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml,加入 24 孔板,每孔加 500 μ l(1×105)個細(xì)胞 ,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度GS-Rg3,37℃、5%CO2孵育24 h后,收集細(xì)胞,用PBS緩沖液洗滌2次。

1.4.2加入 PI染色液 200 μ l、Rnase 50 μ l混勻 ,室溫避光作用30 min,孵育。

1.4.3FCM測定細(xì)胞周期各時相以及AP區(qū)亞峰細(xì)胞百分率。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法用SAS軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,所有數(shù)據(jù)均表示為s,陽性率資料組間采用單因素方差分析,P＜0.05值為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1劑量-效應(yīng)關(guān)系GS-Rg3不同濃度:25、50、100和200 μ g/ml分別與對照組相比,72 h對細(xì)胞增殖的抑制率依次為 33.1%、55.1%、92.8%、82.95%,抑制強度與藥物劑量呈正相關(guān)。濃度為100 μ g/ml其抑制率最高,濃度繼續(xù)增加,抑制率減弱。

時間-效應(yīng)關(guān)系 貼壁的成纖維細(xì)胞在給藥3 h后可見部分細(xì)胞脫落,其抑制效應(yīng)隨時間而明顯增強,72 h處于最高水平。

GS-Rg3濃度在25-100 μ g/ml時對細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,但當(dāng)濃度過高(200 μ g/ml)時對成纖維細(xì)胞的生長無明顯的抑制作用,所以選擇50和100 μ g/ml的GS-Rg3進(jìn)行藥物干預(yù)實驗。見表1。

表1 GS-Rg3對體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的抑制率(s,n=4)

表1 GS-Rg3對體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的抑制率(s,n=4)

GS-Rg3(μ g/100ml)抑制率(%)24 h 48 h 72 h F值 P值25 15.57±6.39 16.15±10.6333.1±4.5 1.55 0.269 50 22.3±4.9535.01±3.4455.1±1.1617.518 0.001 100 89.25±2.73 90.05±2.0992.8±1.30 8.924 0.007 200 88.83±2.08 91.45±0.68 82.95±10.228.075 0.010 F值 18.2980 322.987 796.326 P值 0 0 0

2.2體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞經(jīng)GS-Rg3作用24小時后細(xì)胞周期變化(s,n=4)G1期細(xì)胞比例增多,但S期細(xì)胞比例減少,并呈劑量依賴性,G2無明顯改變。見表2

表2 GS-Rg3對細(xì)胞周期的影響

2.3流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果GS-Rg3作用的成纖維細(xì)胞核內(nèi)DNA裂解形成凋亡峰;Rg3濃度50 μ g/ml時 ,凋亡率 18.85%;Rg3 濃度 100 μ g/ml時 ,凋亡率25.26%。細(xì)胞凋亡比率在一定藥物濃度范圍內(nèi),隨藥物濃度的升高而增加。見表3-表5

表3 流式細(xì)胞儀測定DNA分布圖(與對照組相比,P＜0.01)

表4 GS-Rg3 50μ g/ml細(xì)胞凋亡率18.85%

表5 GS-Rg3 100 μ g/ml細(xì)胞凋亡率 25.26%

3 討論

瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是兩種常見的病理性瘢痕,其特征是大量細(xì)胞增生和過度膠原沉積,而成纖維細(xì)胞是產(chǎn)生膠原的主要細(xì)胞[4]。故成纖維細(xì)胞與病理性瘢痕形成有重要關(guān)系。Kischer等發(fā)現(xiàn)肉芽組織向成熟瘢痕過渡中有凋亡發(fā)生[5]。使我們想到病理性瘢痕的形成不僅由于成纖維細(xì)胞增殖,可能還有成纖維細(xì)胞的凋亡減少共同參與。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞產(chǎn)生一樣都是機體自然的生理過程。這種更新是以細(xì)胞數(shù)量上的恒定為前提的,因此是一種動態(tài)平衡;沒有細(xì)胞生理性死亡,不可能細(xì)胞更新。細(xì)胞產(chǎn)生與細(xì)胞凋亡之間的平衡是機體穩(wěn)態(tài)的基本條件,它們的平衡一旦破壞,就會導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生[6]。

瘢痕疙瘩形成的一個重要因素就是成纖維細(xì)胞合成分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)[7]。細(xì)胞外基質(zhì)主要是由膠原蛋白、蛋白多糖和纖維粘連蛋白等組成。膠原蛋白主要由Ⅰ型和Ⅲ型膠原組成,瘢痕疙瘩Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成明顯升高,尤以I型膠原為主[8,9]。采用形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞進(jìn)行綜合分析,所培養(yǎng)的細(xì)胞為單一的長梭形細(xì)胞,以波形蛋白、I型膠原作為成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白進(jìn)行鑒定,二者均為陽性表達(dá)。證實本研究所采用的培養(yǎng)方法是科學(xué)合理的,可獲得了高純度的成纖維細(xì)胞。

GS-Rg3加入體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中,濃度分別為 0 、25、50 、100、200 μ g/ml,作用時間為 24h 、48h 、72 h。經(jīng)MTT法檢測發(fā)現(xiàn),GS-Rg3對體外成纖維細(xì)胞的抑制率隨濃度的增加和時間的延長而增強,最大抑制率為92.8%,最佳抑制濃度為 100 μ g/ml,因此可見GS-Rg3可抑制成纖維細(xì)胞的增殖,且抑制作用呈劑量、時間依賴性。

我們還發(fā)現(xiàn)貼壁生長的瘢痕成纖維細(xì)胞在給藥后3-4 h可發(fā)生部分細(xì)胞脫落。為進(jìn)一步研究其作用機制,進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測GS-Rg3作用的細(xì)胞與對照組相比,G1期細(xì)胞比例明顯增多,S期細(xì)胞比例明顯減少,并呈明顯的劑量依賴性,G2改變無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗表明GS-Rg3能夠延長細(xì)胞由G1期到S期的進(jìn)程,使細(xì)胞阻滯于G1期。S期是細(xì)胞進(jìn)行大量DNA復(fù)制的階段,組蛋白及非組蛋白也在此期合成,最后完成染色體的復(fù)制,說明GS-Rg3對成纖維細(xì)胞生長的抑制,主要是通過抑制DNA合成來完成的。同時通過流式細(xì)胞儀檢測到GS-Rg3作用的成纖維細(xì)胞核內(nèi)DNA裂解形成凋亡峰。Rg3濃度50 μ g/ml 72小時時,凋亡率 18.85%;Rg3濃度100 μ g/ml 72小時時,凋亡率25.26%。表明GS-Rg3在一定濃度范圍內(nèi)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并且凋亡比率隨藥物濃度的升高而增加。以上兩個實驗結(jié)果說明GS-Rg3可以影響成纖維細(xì)胞周期,這一作用是通過抑制細(xì)胞的DNA合成來實現(xiàn)的,從而達(dá)到抑制成纖維細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,GS-Rg3可能對瘢痕有治療作用,其機理有待于進(jìn)一步深入研究。

細(xì)胞凋亡時,細(xì)胞內(nèi)DNA裂解,在流式細(xì)胞術(shù)的DNA圖上呈現(xiàn)亞二倍體核型峰的特征。細(xì)胞凋亡一個重要特征就是核酸內(nèi)切酶激活,引起DNA的廣泛斷裂,這是流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的理論基礎(chǔ)。應(yīng)用DNA特異性熒光染料染色后,凋亡細(xì)胞染色程度下降,因此流式細(xì)胞術(shù)可對DNA含量進(jìn)行定量分析。在DNA直方圖上,凋亡細(xì)胞出現(xiàn)二倍體(G1)峰細(xì)胞減少,G1峰左側(cè)呈現(xiàn)特征性的亞二倍體(亞G1)峰。而壞死時,細(xì)胞周期中的細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的減少,亞二倍體細(xì)胞量多少不等。亞G1峰可用于凋亡細(xì)胞定量。根據(jù)Anodrew等[10]的觀點,細(xì)胞凋亡是由正常的細(xì)胞周期改變引起的,細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)不僅可以從細(xì)胞的形態(tài)和特征上分析凋亡細(xì)胞,還可以反映細(xì)胞發(fā)生阻滯的時期。

4 結(jié)論

我們的研究表明,GS-Rg3對人成纖維細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,并能夠誘導(dǎo)其凋亡,為臨床應(yīng)用GS-Rg3治療病理性瘢痕提供了理論依據(jù)。由于體內(nèi)外環(huán)境的差異以及瘢痕形成的復(fù)雜性,其臨床應(yīng)用價值還有待于進(jìn)一步研究。

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