席少靜,何 軍,滕艷萍,王曉婕,范 倩

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué),寧夏 銀川750004;2.寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心臟中心,寧夏 銀川750004)

線粒體融合蛋白2基因(mitofusin-2,mfn2)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型基因,該基因位于線粒體的外膜,參與線粒體的融合,調(diào)節(jié)線粒體的新陳代謝和維持線粒體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Mfn2不僅在血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中表達(dá),在心、腦 、肺 、腎、肝組織中亦有廣泛分布。陳光慧等[1]發(fā)現(xiàn)該基因可以有效地阻遏細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞增殖,是一種新發(fā)現(xiàn)的增殖抑制基因。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)是綠色熒光蛋白(GFP)的一種突變體,能在異源組織中表達(dá)并產(chǎn)生熒光,已作為報(bào)告基因廣泛運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。本文通過(guò)大鼠pEGFPmfn2熒光真核表達(dá)載體的構(gòu)建,為下一步轉(zhuǎn)染VSMC,進(jìn)一步研究mfn2抑制VSMC的增殖作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株與質(zhì)粒 大鼠血管平滑肌細(xì)胞株A7r5引自ATCC(CRL-1444);pGEM-T載體購(gòu)自promega公司,pEGFP-N1載體購(gòu)自CLONTECH公司。

1.1.2主要試劑 E.Coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司,DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS緩沖液、0.25%Trypsin+0.02%EDTA購(gòu)自美國(guó)Hyclone,TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen,RT試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ和 BamHⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker購(gòu)自美國(guó)Fermentas,Hot-StarTaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa,DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen,引物合成和測(cè)序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及總RNA的提取 引自ATCC的A7r5,以1∶2接種于新的培養(yǎng)瓶中,放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),約3-5天傳代一次。取一瓶長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,TRIzol法提取A7r5總RNA,測(cè)定總RNA濃度并行1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察總RNA的完整性。

1.2.2mfn2基因的擴(kuò)增和回收 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)得到大鼠mfn2基因cDNA序列(收錄號(hào):NM1-30894),通過(guò)Primer軟件設(shè)計(jì)引物,在上下游引物 5′端分別加入限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基,用于定向克隆。上游引物5′-AGAAGCTTATGTCCCTGCTCTTTTCTC-3′;下游引物 5′-TAGGATCCCGTCTGCCGGGCTGCAG-3′,擴(kuò)增 產(chǎn)物 長(zhǎng)度為2 274 bp。取A7r5總RNA 3 μ g逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,取 5 μ l cDNA 行 PCR。擴(kuò)增條件:95℃5 min、72℃10 min;變性和延伸條件分別為95℃30 s,55℃45 s,72℃1.5 min,5個(gè)循環(huán);95℃30 s,64℃45 s,72℃2.5 min,35個(gè)循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳分離特異性產(chǎn)物,按DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收并測(cè)定PCR產(chǎn)物濃度。

1.2.3重組克隆載體的構(gòu)建 將回收的mfn2cDNA與載體pGEM-T連接成重組克隆載體pGEM-T-mfn2。10 μ l連接體系含純化 PCR 產(chǎn)物 3 μ l,載體 pGEM-T 1 μ l,T4DNA 連接酶1 μ l,10×Buffer 2 μ l,混勻后4℃連接反應(yīng)過(guò)夜。將連接產(chǎn)物10 μ l轉(zhuǎn)化入 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞并行氨芐青霉素(100 mg/L)篩選,以未轉(zhuǎn)染菌和轉(zhuǎn)染載體pGEM-T菌為對(duì)照,采用菌落直接PCR、HindⅢ和BamHⅠ雙酶切和序列分析方法,確定目標(biāo)片段的存在和序列正確性。

1.2.4重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pGEM-T-mfn2的E.coli DH5α增菌后,提取重組質(zhì)粒行HindⅢ和BamHⅠ雙酶切。酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳分離后將目的片段行膠回收并測(cè)定濃度,與經(jīng)相同雙酶切的載體pEGFP-N1連接成重組表達(dá)載體pEGFPmfn2。20 μ l連接體系含回收產(chǎn)物 5 μ l,載體pEGFP-N1 1 μ l,T4DNA 連接酶 1 μ l,10 ×Buffer 2 μ l,混勻后4℃連接反應(yīng)過(guò)夜。將20μ l連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞并行卡那霉素(25 mg/L)篩選,以未轉(zhuǎn)染菌和轉(zhuǎn)染載體pEGFP-N1菌為對(duì)照,經(jīng)菌落直接PCR、HindⅢ和BamHⅠ雙酶切途徑確定目標(biāo)片段的存在。將初步鑒定為陽(yáng)性克隆菌株送至上海生工生物工程公司進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的A7r5細(xì)胞

倒置顯微鏡下見(jiàn)A7r5細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣,貼壁生長(zhǎng)(圖1)。

圖1 培養(yǎng)48小時(shí)的A7r5細(xì)胞

2.2 A7r5總RNA的電泳結(jié)果

A7r5總RNA電泳后顯示三個(gè)條帶,28 s、18 s、5 s,提示提取的總RNA是完整的(圖2)。

圖2 A7r5總 RNA的電泳結(jié)果

2.3 Mfn2基因的克隆與擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示存在約為2.2 kb的特異性條帶,與目的片段(2 274 bp)大小相似,提示Mfn2基因cDNA已獲成功擴(kuò)增(圖3)。

圖3 mfn2目的基因的擴(kuò)增

2.4 重組質(zhì)粒pGEM-T-mfn2的構(gòu)建與鑒定

1為陰性對(duì)照,2為重組克隆載體pGEM-T-mfn2陽(yáng)性菌落直接PCR顯示存在2.2 kb的特異性條帶,3為HindⅢ和BamHⅠ雙酶切得到2.2kb目的條帶和3.0kb的pGEM-T載體,4為HindⅢ單酶切得到的5.2 kb的重組質(zhì)粒,5為重組質(zhì)粒未經(jīng)酶切的電泳圖,提示pGEM-T-mfn2重組質(zhì)粒獲成功構(gòu)建(圖4)。

圖4 重組克隆載體pGEM-T-mfn2的鑒定

2.5 重組表達(dá)載體pEGFPmfn2的構(gòu)建與鑒定

1為陰性對(duì)照,2為重組表達(dá)載體pEGFPmfn2陽(yáng)性菌落直接PCR顯示存在2.2 kb的特異性條帶,3為HindⅢ和BamHⅠ雙酶切得到2.2kb目的條帶和4.7 kb的pEGFP-N1載體,4為HindⅢ單酶切得到的6.9 kb的重組載體,5為重組質(zhì)粒未經(jīng)酶切的電泳圖,提示重組表達(dá)載體pEGFPmfn2獲成功構(gòu)建(圖5)。

圖5 重組真核表達(dá)載體pEGFPmfn2的鑒定

2.6 質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

取pEGFPmfn2質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測(cè)序,所得結(jié)果與genebank報(bào)道的4.1 kb大鼠mfn2 mRNA的cDNA序列(NM-130894)的cds(166,2439)區(qū)域的序列相同,最終證明mfn2基因已被成功插入pEGFP-N1載體中。

3 討論

Mfn2基因位于大鼠的染色體5q36,其全長(zhǎng)cDNA序列為 4 161 bp,收錄至GenBank(編號(hào)NM-130894),其開(kāi)放讀碼框編碼含757個(gè)氨基酸的線粒體膜蛋白,參與線粒體的融合,調(diào)節(jié)和維持線粒體的形態(tài)和功能[2]。目前大量研究顯示該基因與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3-6],已有研究顯示Mfn2的表達(dá)與VSMC的增殖密切相關(guān),在增殖的VSMC中Mfn2的表達(dá)量下降。最新報(bào)道m(xù)fn2生理學(xué)上的重要性提示在線粒體的新陳代謝、凋亡和細(xì)胞信號(hào)起著重要作用[7],并發(fā)現(xiàn)該基因可以經(jīng)由抑制 Ras-Raf-MEK-MAPK通路,抑制細(xì)胞的增殖[8]。

Mfn2基因通過(guò)載體導(dǎo)入后表達(dá)是目前研究Mfn2抑制細(xì)胞增殖作用的主要策略,而轉(zhuǎn)染導(dǎo)入是最為常用且穩(wěn)定高效的研究方法。我們?cè)O(shè)計(jì)特異性引物通過(guò)RT-PCR克隆了Mfn2基因的編碼序列(2 274 bp),并與載體pGEM-T連接構(gòu)建了重組克隆載體,完成了Mfn2基因鑒定和大量制備的目的。氨芐青霉素和α-篩選、HindⅢ和BamHⅠ限制性雙酶切和序列分析等方法證實(shí)了Mfn2基因的存在和序列正確。載體選擇方面,目前腺病毒在Mfn2基因介導(dǎo)中最為常用,但因轉(zhuǎn)染腺病毒存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)是今后研究,尤其是將來(lái)可能的臨床研究所必須正視的。為避免這一問(wèn)題,我們采用了真核表達(dá)載體pEGFPN1,其原因在于其不存在相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn) ,同時(shí)以其為載體構(gòu)建的重組載體可在E.coli和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中穩(wěn)定高效表達(dá),且可采用卡那霉素進(jìn)行篩選。這樣,既可利用E.coliDH5α的高效復(fù)制特性獲得大量重組載體,也為下一步成功轉(zhuǎn)染血管平滑肌細(xì)胞后的篩選提供技術(shù)保障。此外,pEGFP-N1是一種穿梭質(zhì)粒載體,其5’端連接有增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)基因,外源基因可插入到質(zhì)粒載體多克隆位點(diǎn),最終的表達(dá)產(chǎn)物為目的基因所表達(dá)蛋白與熒光蛋白的融合體。我們將Mfn2基因克隆進(jìn)多克隆位點(diǎn),并且與EGFP在同一閱讀框,使其和N端的EGFP融合表達(dá)。同時(shí)由于EGFP性質(zhì)穩(wěn)定,通常不影響目的基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性,因而可以根據(jù)EGFP融合蛋白的綠色熒光的分布來(lái)分析目的蛋白在細(xì)胞中的分布和定位[9]。

VSMC正常位于動(dòng)脈中層,是動(dòng)脈硬化斑塊和內(nèi)膜增生的主要細(xì)胞類(lèi)型。VSMC增殖是高血壓等心血管疾病的一種顯著病理特征。VSMC的增殖和遷移與動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后橋血管閉塞密切相關(guān)。而Mfn2基因是新發(fā)現(xiàn)的一種增殖抑制基因,因此我們?cè)O(shè)想通過(guò)與載體pEGFP-N1構(gòu)建真核表達(dá)載體,通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究Mfn2對(duì)VSMC的增殖抑制作用。

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