林力 祖鳳英 張巍巍 譚鵬 王剛 李光賾 蒙莉

復(fù)方雙參通冠由人參、丹參和元胡三藥有效部位組成，臨床主要用于治療氣血郁滯、心失所養(yǎng)所致的冠心病心絞痛。方中君藥人參自古作為“開心益智、輕身延年”的上品，其主要成分采用人參總皂苷，人參皂苷是人參所含的最為重要的一類生理活性物質(zhì)，約占人參組成的3%?，F(xiàn)代藥理研究表明人參皂苷具有改善微循環(huán)、提高組織抗缺氧能力、抑制血小板聚集、抗腫瘤、抗衰老等多種生物活性，近年來人們發(fā)現(xiàn)其在心血管系統(tǒng)中也具有較好的作用，可以保護(hù)心功能、阻滯鈣通道、抗自由基、抗休克、抗腦缺血、保護(hù)腦損傷等［1］。本室前期整體藥理學(xué)和細(xì)胞藥理學(xué)研究都顯示復(fù)方配伍給藥的藥效要優(yōu)于人參給藥的藥效。本文嘗試從藥代動力學(xué)角度，探討復(fù)方配伍對皂苷中Rg1、Re、Rb1和Rd四種成分腸吸收的影響，以期闡釋復(fù)方配伍應(yīng)用的合理性。

1 材料和儀器

1.1 藥品和試劑 Ginsenoside Rg1，Re和Rb1對照品，均購自中藥藥品生物制品檢定所;Ginsenoside Rd對照品，南京青澤醫(yī)藥，純度大于98%。人參總皂苷、丹參總酚酸和延胡索總生物堿均由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥學(xué)室m提供，批號依次為040801、050816和060927。

牛血清白蛋白Ⅴ購自北京世紀(jì)銀豐，考馬斯亮藍(lán)G-250購自華美生物工程有限公司;Tissue Culture 199培養(yǎng)基(Invitrogen Corporation)，北京夏斯生物科技有限公司;甲酸和甲醇均為色譜純，分別購自美國Fisher公司和J.T.BAKER公司;水為娃哈哈飲用純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn);其他試劑均為市售分析純。

1.2 實驗動物 Wistar大鼠，雄性，體重為(220±20)g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗研究中心提供，許可證號SCXY(京)2004-0001。

1.3 實驗儀器 API 4000 Q-TRAP型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有離子噴霧離子源以及Analysis 1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，美國Applied Biosystem公司;Agilent 1200高效液相色譜輸液泵，自動進(jìn)樣器，Agilent 8453紫外可見分光光度儀，色譜柱為 Agilent ZORBAX SB-C18 柱(150 × 4.6 mm I.D.，5 μm)，均為美國Agilent公司。Micro 22R臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Hettich公司;AG-245分析天平和320 pH計，美國Mettler Toledo公司。

2 實驗方法

2.1 樣品溶液配制 實驗分為人參總皂苷組和復(fù)方組，取各組樣品適量，用TC199培養(yǎng)液分別配制成濃度為0.0625、0.125、0.25 mg/ml和 0.281、0.563、1.125 mg/ml的溶液(兩組中含有人參提取物的量相同)，待用。

2.2 腸囊的制備和孵育 實驗采用改良的大鼠腸囊外翻法［2］進(jìn)行研究。取禁食后大鼠，脫頸椎處死，從胃幽門以下15 cm開始向下取出整段小腸，用生理鹽水灌洗后轉(zhuǎn)移至TC199培養(yǎng)液中，剝離腸表面的脂肪及血管，將其分成4.5 cm左右的腸囊，外翻后內(nèi)側(cè)注入0.8 ml的TC199溶液，外側(cè)加入含有待測藥品的TC199培養(yǎng)基溶液，于37℃振蕩水浴(60 cycle/min)中孵育，在 120 min 取樣 200 μl，4℃高速離心后待測。同時取出腸囊，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法［3］進(jìn)行蛋白含量的測定。每個時間點實驗重復(fù)3次。

2.3 腸囊吸收成分定量分析方法 色譜條件:色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱(150 ×4.6 mm I.D.，5 m)，流動相為甲醇-0.1%的甲酸溶液，梯度洗脫(0-4 min-58%MeOH，6 min-90%MeOH，6.01 min-58%MeOH)。流速為 0.5 ml/min，柱溫為 20℃。

質(zhì)譜條件:離子噴射電壓5500 V，源內(nèi)氣體GS1為448.18 Kpa，源內(nèi)氣體GS2為310.28 Kpa，氣簾氣體137.9 Kpa，碰撞氣High，源內(nèi)溫度500℃。檢測方式為正離子檢測，掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(MRM)方式，用于定量分析的離子對(m/z):823.6/203.1(人參皂苷 Rg1)，969.7/789.0(人參皂苷Re)，1131.8/365.1(人參皂苷Rb1)和823.6/789.5(人參皂苷Rd)。

2.4 數(shù)據(jù)分析 小腸對藥物的吸收可能由于有效吸收面積的不同而不同，因此不能以直接測定的藥物濃度來計算藥物的腸吸收?？紤]到精確測定腸囊表面積較為困難，同時由于腸表面積與腸蛋白含量具有一定的線性關(guān)系［2］，因此本文采用腸蛋白量進(jìn)行校正，以消除不同批次腸囊大小對吸收結(jié)果的差異。對于不同配伍引起化合物的吸收差異，用單位腸蛋白累積吸收總量表示。實驗采用EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，實驗結(jié)果用“±s”表示，不同給藥方式下腸轉(zhuǎn)運藥物差別用t檢驗。

3 實驗結(jié)果

3.1 LC-MS-MS方法學(xué)確證

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 取TC199培養(yǎng)液160 L，依次加入人參皂苷系列對照品溶液40 L，按2.2樣品處理項下操作，建立工作曲線。用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運算，求得直線回歸方程。Rg1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y =71563.172+10871.216 X，相關(guān)系數(shù)0.990，權(quán)重為W=1/CC，線性范圍10～5000 ng/ml;Re的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y =37118.760 +6273.083 X，相關(guān)系數(shù)0.993，權(quán)重為W=1/CC，線性范圍10～5000 ng/mL;Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y =-48550.506+11633.850 X，相關(guān)系數(shù)0.995，權(quán)重為W=1/CC，線性范圍10～5000 ng/mL;Rd的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y =2540.112+1173.579 X，相關(guān)系數(shù)0.999，權(quán)重為W=1/CC，線性范圍4～2000 ng/mL。

3.1.2 回收率、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性實驗 在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)選擇高、中和低三種濃度(人參皂苷Rg1、Re和Rb1的三個濃度分別為25、100和5000 ng/ml，人參皂苷Rd分別為8、80和2000 ng/ml)，以空白 TC199配制人參皂苷 Rg1、Re、Rb1和Rd三個濃度的QC樣品，每個濃度點5份樣品，將相同濃度的樣品按照樣品處理方法與處理后分析，分別計算其回收率精密度和準(zhǔn)確度實驗。三種濃度下Rg1、Re、Rb1和Rd的回收率為70% ～100%，精密度的RSD在0.33% ～14.44%之間，準(zhǔn)確度在81%～101%之間。人參皂苷在室溫24h空白TC199中樣品穩(wěn)定性符合測定要求。

3.1.3 小結(jié) 本方法生物樣品中人參皂苷類成分的測定方法表明:TC199培養(yǎng)液中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾樣品的測定，藥物平均回收率均在70%以上，變異系數(shù)小于15%;最低定量限Rg1、Re和Rb1均為10 ng/mL，Rd為4 ng/ml，相關(guān)系數(shù)均超過了0.99，日內(nèi)精密度和穩(wěn)定性符合相關(guān)要求。

3.2 組分配伍對腸吸收成分影響結(jié)果 不同劑量組下組分配伍給藥和單一組分給藥在各時間點測定結(jié)果如表1所示，實驗結(jié)果表明對于人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd在低劑量組組分配伍給藥均促進(jìn)其吸收，中劑量和高劑量組分配伍給藥與單一組分給藥沒有統(tǒng)計學(xué)差異，但有隨著劑量的增加組分配伍給藥有抑制成分吸收的趨勢。

表1 四種人參皂苷吸收情況(ng/mg protein)

4 討論

人參皂苷是人參中十分重要的一類主要成分，具有非常廣泛的藥理作用，但過低的口服生物利用度嚴(yán)重限制了其應(yīng)用和發(fā)展的前景，目前很多學(xué)者嘗試從體外腸吸收實驗探討原因，如李昊等［4］應(yīng)用LC-MS方法從腸道吸收這個環(huán)節(jié)對其Rg1生物利用度低的原因進(jìn)行了初步的探索，結(jié)果表明Rg1比較容易透過腸壁屏障，其吸收呈明顯的時間依賴性。同時考察了P-糖蛋白對Rg1的影響，結(jié)果表明加入P-糖蛋白抑制劑組與不加組統(tǒng)計學(xué)分析表明無顯著性差異，表明P-糖蛋白對藥物的外排作用可能也不是造成其生物利用度低的原因。彭纓［5］采用在體小腸回流試驗裝置對Re的大鼠小腸吸收動力學(xué)進(jìn)行了研究。實驗結(jié)果表明，Re在大鼠小腸內(nèi)吸收率為9.6%。本實驗也應(yīng)用腸外翻方法，但研究目的是探討不同給藥方式對人參主要成分吸收的規(guī)律研究。

本實驗應(yīng)用LC-MS/MS方法對探討了復(fù)方配伍對人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd四個成分腸吸收的影響，結(jié)果顯示在低劑量組，復(fù)方配伍可以增加四種皂苷類成分的吸收，但在中劑量和高劑量組下，復(fù)方配伍給藥和單一組分給藥對這四種皂苷類成分的吸收影響沒有顯著差異。表明復(fù)方配伍后藥效的增加不是與配伍在吸收環(huán)節(jié)增加了皂苷類成分的吸收有關(guān)，具體原因有待于進(jìn)一步的研究。

［1］Wang Xiao-mo.Progress of Pharmacological Action of Ginseng.Ginseng Rearch，2001，13(3):2-10.

［2］Barthe L，Bessouet M，Woodley J F，et al.The improved everted gut sac:a simple method to study intestinal P-glycoprotein.Int J Pharm，1998，173:255-258.

［3］Wilson TH，Wiseman G.The use of sacs of everted of substances from the mucusoal to the serosal surface. J Physiol，1954，123:117.

［4］李昊，孫建國，謝海棠，王睿，等.大鼠腸管外翻模型對人參皂苷Rg1吸收機(jī)制的研究.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2000，9(5):510-513.

［5］彭纓.人參皂苷Re及其固體分散物藥物動力學(xué)研究.沈陽藥科大學(xué)，2001.