譚力力 于 波* 李 璐 趙紅麗 郭 旭

1 沈陽醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院心內(nèi)科（110002）

2 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科（110000）

3 沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院（110000）

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAS）是一類重要的生物活性物質(zhì)，廣泛存在于多種組織。RAS系統(tǒng)在生理情況下對血壓調(diào)控、水鹽代謝起著重要作用，而在病理情況下，組織中RAS增加與高血壓、動脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡、心力衰竭等密切相關(guān)。而縫隙連接蛋白43（Cx43）是心室肌細(xì)胞含量最豐富的連接蛋白，其表達(dá)水平的降低和分布異常，可使心肌細(xì)胞間的傳導(dǎo)發(fā)生改變，形成折返環(huán)路而發(fā)生室性心律失常[1]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心力衰竭患者心肌中Cx43基因和蛋白表達(dá)都明顯下調(diào)，其表達(dá)分布的異常將引起惡性室性心律失常和心源性猝死的發(fā)生[2]。長期的高血壓可以導(dǎo)致心肌纖維化和左室重塑，而高血壓與Cx43及醛固酮受體拮抗劑對其的干預(yù)機(jī)制卻鮮有報道，因此本實(shí)驗(yàn)采用Wistar大鼠和SHR大鼠為模型，就醛固酮對Cx43表達(dá)的影響及依普利酮對其的干預(yù)作進(jìn)一步的研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及藥品

取20只8周雄性自發(fā)性高血壓大鼠（體質(zhì)量200g左右）分為高血壓組（A組），依普利酮組（B組），每組10只，再取同周齡雄性Wistar大鼠（均購于北京維通麗華公司）10只（C組），次日晨B組空腹加喂依普利酮（購于博士德公司），100mg/（kg·d）[3]灌胃；A組和C組給予生理鹽水灌胃，均喂養(yǎng)8周。

1.2 在體研究

分別于喂養(yǎng)2、4、6、8周采用大鼠尾動脈測壓儀測量大鼠尾動脈壓，比較血壓的波動情況。

1.3 標(biāo)本采集及處理

取部分心肌組織置于40g/L中性甲醛液中固定，石蠟包埋，取2張切片，其中1張用于HE染色，以觀察心肌組織的大致形態(tài)及纖維化程度，另1張用于免疫組織化學(xué)染色，觀察Cx43分布情況。

1.4 心肌HE染色

首先，將切片放于85℃烤箱內(nèi)，烘烤切片約10min；然后，將該切片浸泡于二甲苯中10min，后更換二甲苯再浸泡10min，再水洗；用1%的蘇木素中染色3min；放入鹽酸酒精濃度1%進(jìn)行分色，再流水沖洗反藍(lán)；用0.5%伊木紅染液進(jìn)行染色3min，再流水沖洗，放入雙蒸水，樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌纖維化的變化程度。

1.5 心肌Cx43 的分布情況采用免疫組織化學(xué)方法觀察

實(shí)驗(yàn)步驟按試劑說明書進(jìn)行（試劑購自博士德生物工程公司）。用彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，對Cx43 表達(dá)分布進(jìn)行觀察分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血壓比較

3組大鼠尾動脈血壓顯示，高血壓組平均動脈壓較Wistar組顯著升高；依普利酮組平均動脈壓較高血壓組顯著降低，而和Wistar組無顯著差異（比較中P＜0.01），見表1。

表1 組大鼠尾動脈血壓比較（mmHg）

2.2 各組大鼠心肌病理的變化

大鼠心肌組織纖維分布正常對照組均勻纖細(xì)；高血壓組心肌纖維排列紊亂、纖維粗大，而依普利酮干預(yù)后，心肌纖維化程度明顯改善（圖1）。

圖1 各組大鼠心肌病理的變化

2.3 免疫組織化學(xué)學(xué)染色

染色后，觀察Wistar組心室肌Cx43陽性的縫隙連接蛋白（棕色顆粒狀）分布密集，排列規(guī)律，位于心肌細(xì)胞長軸的彼此連接處，而高血壓組Cx43在心肌細(xì)胞的分布呈側(cè)邊化，依普利酮組Cx43分布不均、程度明顯減輕（圖2）。

圖2 心肌Cx43免疫組織化學(xué)染色觀察

3 分 析

目前，高血壓以經(jīng)成為臨床一種常見病、多發(fā)病，長期的高血壓可以導(dǎo)致心室重塑和心肌纖維化，心室肥大、心力衰竭。心肌肥大明顯增加心血管病病死率，其機(jī)制與心肌肥大所致的電生理重構(gòu)有關(guān)。而細(xì)胞縫隙連接（Gap Junction，GJ）是心肌細(xì)胞間惟一具有電連接作用的細(xì)胞間連接形式，對細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等生理過程也起著重要的調(diào)控作用[4]。在連接蛋白中，其中Cx43 在心肌中最為重要，Cx43和分布的異常是多種心律失常的基礎(chǔ)。

RAS系統(tǒng)的激活，一方面可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流增加，細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增加可激活Ca2+依賴的蛋白酶Calpains，導(dǎo)致溶酶體釋放[5]，而且可激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calaineuin，CaN），使Cx43肽鏈C端368位點(diǎn)去磷酸化，從而使Cx43降解增加，含量降低。Cx43降解后重新分布，多數(shù)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞側(cè)邊，正如實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示：正常心肌Cx43陽性的GJ分布密集，排列規(guī)律。而高血壓組心肌縱切面縫隙連接蛋白分布紊亂，甚至缺如。從而使心肌細(xì)胞各向性的傳導(dǎo)不均衡，電傳波不一致，導(dǎo)致傳導(dǎo)速度和方向改變，產(chǎn)生折返性心律失常。上述變化尤以心室肌明顯，考慮與Cx43主要分布在心室有關(guān)。長期的高血壓可導(dǎo)致心室重塑，而Cx43主要分布在心室，可以推出高血壓大鼠心肌Cx43數(shù)量減少，分布紊亂，與本實(shí)驗(yàn)相符，而給予醛固酮受體拮抗劑依普利酮干預(yù)后，Cx43較高血壓組比較，數(shù)量增加，分布規(guī)律。推測其作用機(jī)制可能是通過抑制醛固酮的釋放進(jìn)而降低心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，抑制與Ca2+有關(guān)的蛋白酶的合成、釋放，減輕Cx43的降解，從而減輕Cx43分布紊亂程度。

醛固酮受體拮抗劑一般用于心功能不全和高血壓左室肥厚患者，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在使用螺內(nèi)酯后缺血/再灌注心律失常的發(fā)生率降低，顯示醛固酮受體拮抗劑具有一定的抗心律失常作用。許多學(xué)者認(rèn)為，醛固酮受體拮抗劑防治室性心律失常的作用機(jī)制主要與抗心室心肌纖維化、抗結(jié)構(gòu)重構(gòu)和抗電重構(gòu)等機(jī)制有關(guān)。有研究顯示，Cx43表達(dá)和分布異?？梢詫?dǎo)致細(xì)胞間傳導(dǎo)減慢和電傳導(dǎo)耦聯(lián)能力的下降，從而引起多種心律失常。本研究發(fā)現(xiàn)，使用依普利酮后，高血壓所致Cx43含量減少的程度較未用藥組減輕，分布不均一改善，提示醛固酮受體拮抗劑能有效減輕心室Cx43的重構(gòu)，但其具體機(jī)制需做進(jìn)一步的研究。

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