鄧福金,吳慶榮,王化青

(1.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟管理站,遼寧沈陽110032;2.遼寧省農(nóng)村發(fā)展研究中心,遼寧沈陽110032)

自二十世紀五十年代英國人Polge和Smith發(fā)現(xiàn)了甘油對精子的保護作用,并使精液冷凍技術獲得成功以來,在牛冷凍精液生產(chǎn)上已經(jīng)得到廣泛應用,并且取得了較高的受胎率。但是近些年來,牛精液冷凍技術進展緩慢,雖然在精液冷凍方法、稀釋方法和稀釋液配方等方面不斷加以改進,使冷凍精液精子復蘇率有所提高,但變化不大,主要原因是缺乏對精子復蘇規(guī)律的研究[1]。

精液冷凍時,冰晶首先在細胞外的保護液中形成,大約在-10℃以上,細胞內(nèi)的水仍不結冰,但變得愈益過冷。當繼續(xù)降溫時,加快細胞外水的冰晶形成,而在未結冰的水中,溶質的濃度越來越高。這就使細胞內(nèi)過冷溶液和細胞外愈益變濃的溶質之間的化學勢出現(xiàn)巨大差異[2],要消除這種差異主要取決于精液的降溫速率。本試驗從冷凍溫度的選擇,研究冷凍溫度對精子復蘇率的影響及精液降溫速率變化規(guī)律,達到提高精子復蘇率的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用本站5頭種公牛精液,法國卡蘇公司生產(chǎn)的無動物源性稀釋液,法國大歐公司生產(chǎn)的 0.25 mL細管。日本Olympus BX41型生物相差顯微鏡及顯視系統(tǒng),日本富士平工業(yè)株式會社生產(chǎn)的TSM-160MHS型電腦程控冷凍儀及FA113型低溫平衡柜,北京宇時技術開發(fā)公司生產(chǎn)的MCT-200型自動數(shù)字測溫儀,鉆石牌血球分類計數(shù)器。

1.2 試驗方法

試驗采用優(yōu)選法[3]確定精液冷凍溫度點。每個冷凍溫度點試驗程序相同,根據(jù)精液在每個冷凍溫度點冷凍后精子復蘇率情況,找出精液適宜冷凍溫度范圍及降溫速率,并根據(jù)測溫數(shù)據(jù)繪制出精液適宜降溫變化曲線。每次冷凍6支細管精液,將測溫儀探頭置于其中一支細管精液中固定,用于測定冷凍過程中細管內(nèi)精液溫度變化,另外5支細管精液每頭牛各1支。精液冷凍前要擺放在冷凍架上,置于+4℃平衡柜中降溫平衡。

表1 不同冷凍溫度精子復蘇率變化

1.3 試驗程序

冷凍前,將冷凍儀溫度調至所需要的冷凍點溫度[4],測溫儀自動記錄間隔時間設置為10 s。冷凍時,取出平衡柜中準備好的精液樣品同冷凍架一起迅速放入冷凍儀中,關閉冷凍儀上蓋,同時打開測溫儀報警和記錄按鈕,測溫儀按照預先設定的時間間隔自動報警并記錄每一時刻的溫度,當精液溫度降至試驗所設置的溫度時,向冷凍儀內(nèi)噴入液氮,至精液溫度降至-130℃以下時,取出樣品精液投入-196℃液氮中待檢。

1.4 精子活率評定方法

活率是指精液中直線前進運動精子數(shù)占精子總數(shù)的百分率。精子活率評定采用死活染色法[5],即取1滴精液,滴入盛有1～1.5 mL 1%剛果紅染色液中,于37℃溫度下浸染15 min,鏡檢前取1滴浸染后的精液和1滴5%苯胺蘭染色液混合復染,涂片晾干后在400倍顯微鏡下觀察,死精子著紅色,活精子不著色,每個片子至少觀察200個以上精子,根據(jù)死活精子數(shù)量計算精子活率。

2 結果與分析

2.1 不同冷凍溫度對精子復蘇率的影響

從表1可以看出,精液在-98℃冷凍精子復蘇率最高,為73%。精液遠離-98℃冷凍精子復蘇率下降。精液在-86～-118℃范圍冷凍精子復蘇率較高,為65%。精液在-86～-118℃范圍外冷凍,精子復蘇率明顯下降。

2.2 精液降溫速率變化規(guī)律

從圖1可以看出,精液冷凍過程降溫速率不是勻速的,在 +4～-10℃范圍,平均降溫速率為7℃/min;在-10～-80 ℃范圍,平均降溫速率為35℃/min;在-80～-130℃范圍,平均降溫速率為 7℃/min。精液在-10～-80℃平均降溫速率(35℃/min)與精液在-98℃降溫速率(32.5℃/min)十分接近,說明精液發(fā)生相變階段適宜的降溫速率是提高精子復蘇率的關鍵。

圖1 精液適宜降溫變化曲線

3 討論

1)當精液在較低溫度冷凍時,細胞內(nèi)的水先形成冰晶,由于形成的冰晶對細胞產(chǎn)生機械損傷,從而造成精子死亡;當精液在較高溫度冷凍時,細胞外的水先形成冰晶,由于形成冰晶產(chǎn)生溶液效應,導致細胞脫水、蛋白質變性,同樣造成精子死亡;當精液在適宜溫度冷凍時,液體結晶、細胞脫水之間接近于合適的關系,對細胞造成的損傷最小,有利于冷凍后精子復蘇。因此,通過控制精液冷凍溫度能有效提高精子復蘇率。

2)影響精液降溫速率的因素主要取決于冷凍溫度和每次冷凍細管精液的數(shù)量。冷凍溫度越高、冷凍細管精液數(shù)量越多,精液降溫速率越慢;冷凍溫度越低、冷凍細管精液數(shù)量越少,精液降溫速率越快。使用自制冷凍槽或廣口液氮罐冷凍細管精液,通過調整冷凍架與液氮面之間的距離來控制精液的冷凍溫度,冷凍溫度一般控制在-120～-140℃之間,冷凍時溫度回升不得高于-90℃[6]。

3)細胞內(nèi)冰晶的形成和細胞外溶液效應與精液的降溫速率之間各為正負相[7],這就使精子活率與精液降溫速率之間的相關曲線呈“V”字形。當精液以較快的速率降溫時,細胞內(nèi)形成冰晶的可能性是1,精子由于受到機械性損傷而死亡;當精液以較慢的速率降溫時,細胞內(nèi)形成冰晶的可能性是0,精子可能被溶液效應所致死。所謂最適宜降溫速率是使細胞內(nèi)形成冰晶的可能性和細胞外溶液效應都降低到最低程度。

4 結論

1)精液在不同的溫度下冷凍,其精子復蘇率是不同的。試驗結果表明,精液在-98℃冷凍,精子復蘇率最高;在-86～-118℃范圍冷凍,精子復蘇率較高;遠離-86～-118℃范圍冷凍,精子復蘇率明顯下降。

2)精液冷凍過程的降溫速率是不同的。相變前,精液平均降溫速率比較緩慢為7℃/min;相變過程精液降溫迅速,平均降溫速率為35℃/min;相變后,精液降溫速率又開始緩慢,平均降溫速率為10℃/min[8]。精液冷凍成敗的關鍵是控制精液發(fā)生相變階段的降溫速率。

[1]沈家森,童孚中.公牛繁殖技術資料匯編[C].南京:農(nóng)業(yè)部牛冷凍精液質量監(jiān)督檢驗測試中心,2005,1.

[2]張堅中,徐鐵錚.家畜冷凍精液[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,1988.

[3]王元, 楊德莊.華羅庚的數(shù)學生涯[M].北京:北京科學出版社,2000.

[4]張儒學.有效控制精液冷凍初凍溫度的方法[A].全國第七次動物繁殖學術討論會論文摘要匯編[C].廣州:中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會,1993.P27.

[5]楊學時,同廣輔.全國牛冷凍精液國家標準培訓班技術輔導教材[M].吉林:中國農(nóng)業(yè)出版社,1985,7.

[6]陳偉生,等.牛冷凍精液生產(chǎn)質量管理手冊[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2006,9.

[7]董偉.細胞低溫生物學的基本問題[A].第九屆國際家畜繁殖會議論文[C].1981,6,P.38-40.

[8]鄧福金,等.牛細管精液冷凍溫度曲線的研究[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2006(12):10-12.