聶青和 羅新棟 黃曉峰 張亞飛 程勇前

丙型肝炎病毒（HCV）在我國(guó)一般人群中的感染率約為3.2%。1991年后由于已對(duì)獻(xiàn)血員常規(guī)進(jìn)行HCV的篩檢，使輸血后丙型肝炎的發(fā)生率大為減少[1]，但預(yù)防母嬰間宮內(nèi)、分娩時(shí)及產(chǎn)后感染HCV已成為當(dāng)前及今后研究的重要問(wèn)題[2]。現(xiàn)研究證實(shí)，HCV可經(jīng)胎盤(pán)引起胎兒感染，宮內(nèi)感染是HCV傳播的一條重要途徑。目前有關(guān)這方面的研究多數(shù)為流行病學(xué)調(diào)查，至于HCV如何在母嬰間傳播的分子機(jī)制研究報(bào)道還甚少[3]。理論上說(shuō)，HCV經(jīng)胎盤(pán)感染胎兒首先必須突破胎盤(pán)屏障的第一道防線，即滋養(yǎng)層細(xì)胞。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者在離體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（HIV）、流感A病毒、貓感染性腹膜炎病毒、柯薩奇病毒、登革熱病毒等二十余種病毒在感染過(guò)程中存在抗體依賴的感染增強(qiáng)作用（ADE）[4]。HIV-1的ADE作用機(jī)制比較復(fù)雜，可能包括多種途徑同時(shí)起作用，其中由FcγRⅢ（CD16）介導(dǎo)的進(jìn)入滋養(yǎng)層細(xì)胞的ADE機(jī)制已經(jīng)初步被證實(shí)。在HCV感染胎兒過(guò)程中是否也存在ADE作用機(jī)制？因而我們推測(cè)，HCV宮內(nèi)感染存在同樣的分子機(jī)制，其感染滋養(yǎng)層細(xì)胞需FcγRⅢ受體的非特異性介導(dǎo)。

材料與方法

一、主要試劑 Percoll細(xì)胞分離液為美國(guó)Pharmacia公司產(chǎn)品；免疫組織化學(xué)染色用ABC試劑盒及HCV RNA定性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自華美公司；細(xì)胞角蛋白及波形蛋白抗體購(gòu)自寶泰克公司；QIAmp viral RNA提取試劑盒為德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品；CD81和LDL-R鼠抗人單克隆抗體（McAb）均為Serotec公司產(chǎn)品。CD16鼠抗人單抗由本校免疫教研室歐陽(yáng)為明博士惠贈(zèng)；小鼠HCV NS5及NS3 McAb由北京大學(xué)人民醫(yī)院魏來(lái)教授惠贈(zèng)；小鼠HCV-C（CP10）McAb由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院郝飛教授惠贈(zèng)；SPA-膠體金（5nm）購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司。

二、引物 由寶生物（大連）有限公司合成。F外（493～518）：5’-GCAACAGGGAACCTT CCTGGTTGCTC-3’，R外（987～964）：5’-CGTAGGGGCCAGTTCATCATCATCATCAT-3’，F(xiàn) 內(nèi) （502 ～527）：5’-AACCTTCCTGGTTGCTCTTTCTCTAT-3’，R 內(nèi) （957 ～952）：5’-GTTCATCATC ATATCCCATGCCAT-3’，內(nèi)引物擴(kuò)增的cDNA長(zhǎng)度為474bp。

三、HCV陽(yáng)性血清 取自我科住院的丙型肝炎患者，經(jīng)檢測(cè)HAV、HBV、HDV、HEV標(biāo)志物均陰性，抗-CMV、抗-EBV、抗-HIV均陰性；抗 HCV陽(yáng)性，HCV RNA為2.1×106copies/ml。HCV基因分型為Ib型，患者尚未經(jīng)抗病毒藥物治療。無(wú)菌采集血清，分裝后-20℃凍存，用前經(jīng)56℃、30min滅活補(bǔ)體。正常血清來(lái)自門(mén)診體檢人員，經(jīng)檢測(cè) HAV、HBV、HCV、HDV、HEV標(biāo)志物均陰性，抗-HIV陰性，肝功能正常。

四、體外細(xì)胞培養(yǎng)[5]取健康（血清HBV、HCV標(biāo)志物均陰性，抗-HIV陰性，肝功能正常）妊娠6～10周孕婦新鮮流產(chǎn)胎兒胎盤(pán)組織。以Percoll等密度梯度沉降法純化滋養(yǎng)層細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)特性，并采用ABC法檢測(cè)細(xì)胞角蛋白、波形蛋白表達(dá)以對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

五、體外細(xì)胞感染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滋養(yǎng)層細(xì)胞棄去上清，分別用1ml抗HCV陽(yáng)性血清和正常血清，置于37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)2h，加入DMEM（不含小牛血清）3ml過(guò)夜。次日棄去上清，用1×PBS洗滌7次，再加入含10%小牛血清的完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵化2天，以透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HCV顆粒。剩余的感染細(xì)胞重復(fù)感染1次，2天后進(jìn)行免疫電鏡法檢測(cè)（采用包埋前反應(yīng)法）[6]。另將4瓶滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)后，留取上清待檢。然后按照以下方式進(jìn)行感染：（1）對(duì)照組：加入20%正常血清；（2）補(bǔ)體滅活組：加入20%HCV RNA陽(yáng)性血清（經(jīng)56℃、30min滅活補(bǔ)體）；（3）CD16 McAb組：先以含 1：150 CD16 McAb的培養(yǎng)液與細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h，棄去，更換含HCV RNA陽(yáng)性血清（未滅活）和20%高糖DMEM培養(yǎng)液；（4）全血清組：加入含HCV RNA陽(yáng)性血清（未滅活）和20%高糖DMEM培養(yǎng)液。置于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育24h后，以高糖DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞5次，留取最后一次洗液待檢。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)重新加入完全高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染后每3天收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞，然后再加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，保持培養(yǎng)液體積4ml。共觀察21天，每次收集的上清和細(xì)胞立即提取RNA儲(chǔ)存供檢測(cè)用。

六、RNA提取及HCV RNA正鏈檢測(cè) 將各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育24小時(shí)后，以高糖DMEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞5次。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)重新加入完全高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染3天后收集培養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，然后取細(xì)胞懸液200μl，用QIAmp viral RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)病毒RNA，操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后收集病毒RNA，采用ROCHE Lightcycler熒光PCR檢測(cè)儀定量檢測(cè)（深圳匹基生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，拷貝數(shù)＜102copies/ml為陰性）。

七、HCV RNA負(fù)鏈檢測(cè) 檢測(cè)材料為以上各組細(xì)胞提取的細(xì)胞內(nèi)RNA和培養(yǎng)液上清RNA。取出凍存RNA，60℃水浴 5min以解聚。反應(yīng)體系：RNA10μl、4dNTP2μl、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 5 ×buffer4μl、RNasin1μl、AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 1μl、F 外 2μl混勻后，42℃保溫 2h進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。結(jié)束后95℃ 5min滅活A(yù)MV酶。第一次PCR循環(huán)：反應(yīng)體系：cDNA2μl、F外、R 外各 1μl、4dNTP2μl、Taq 酶 10×buffer2μl、Taq酶 0.5μl、MgCL21.5μl、DEPC 純水 10μl混勻后，滴加兩滴液體石蠟，離心數(shù)秒鐘，按下列參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。預(yù)變性：95℃ 300s、94℃ 60s、56℃ 60s、72℃ 60s，共 35個(gè)循環(huán)，終延伸72℃ 300s；第二次PCR循環(huán)：反應(yīng)體系：第一循環(huán)產(chǎn)物 2μl、F 內(nèi)、R 內(nèi)各 1μl、4dNTP2μl、Taq 酶 10×buffer2μl、Taq 酶 0.5μl、MgCL21.5μl、DEPC純水10μl混勻后，滴加兩滴液體石蠟，離心數(shù)秒鐘，按下列參數(shù)進(jìn)行第二次擴(kuò)增。預(yù)變性：95℃ 300s、94℃ 60s、58℃ 30s、72℃ 60s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，終延伸72℃ 300s。各組細(xì)胞在感染后6天用細(xì)胞爬片同時(shí)進(jìn)行HCV NS5、NS3和C區(qū)抗原的免疫組化檢測(cè)，使用華美公司ABC試劑盒，按說(shuō)明書(shū)步驟操作。

八、細(xì)胞內(nèi)HCV包膜蛋白的免疫電鏡檢測(cè) 將PBS洗滌后的細(xì)胞1000r/min離心20min后，4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合液固定1h。加入1%Triton X-100（以 0.05mol/L TBS配制）37℃作用 10min；0.05mol/L TBS洗滌3次后加入1%牛血清白蛋白（BSA）37℃處理30min。感染組和對(duì)照組分別加入1：150的鼠抗HCV E2包膜蛋白多克隆抗體，置37℃1h。0.02mol/L TBS洗滌3次，再經(jīng)1%BSA于37℃處理30min后，加入1：200膠體金標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃作用1h。用0.02mol/L TBS洗滌10min，再用0.05mol/L PBS洗滌3次；加入1%BSA，2000r/m離心10min，棄上清。加入4%戊二醛使細(xì)胞固定成團(tuán)，于LKBⅢ型切片機(jī)上做超薄切片（500埃），在本校電鏡室透射電鏡（日本Jeol公司JEM-100SX 型）下觀察。

結(jié) 果

一、透射電鏡觀察 分離培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，核大，呈卵圓形，位于胞質(zhì)近中央，胞漿豐富透明，細(xì)胞呈片狀鋪展生長(zhǎng)。透射電鏡下，可見(jiàn)培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞外有大量的微絨毛，偶見(jiàn)包被陷窩，胞質(zhì)中線粒體大而多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與糖原顆粒清晰可辯，還可見(jiàn)到電子密度高的脂滴。經(jīng)鑒定培養(yǎng)的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞純度超過(guò)95%。透射電鏡下可見(jiàn)HCV感染的滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)清晰，有明顯的絨毛樣突起，細(xì)胞核呈膜狀結(jié)構(gòu)包繞的電子密度較高區(qū)域?？擅黠@分辨出胞漿中的線粒體、溶酶體等細(xì)胞器。部分細(xì)胞中有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張和空泡樣變，有部分細(xì)胞胞漿內(nèi)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)可見(jiàn)病毒樣顆粒，顆粒大小為50nm左右，表現(xiàn)為周圍有電子密度較低的膜狀結(jié)構(gòu)包繞，中間有電子密度較高的物質(zhì)（可能為其遺傳物質(zhì)），形狀近圓形。還可以見(jiàn)到病毒進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程中形成的吞噬小泡，有的病毒樣顆粒附近可見(jiàn)溶酶體聚集，同時(shí)溶酶體內(nèi)也可見(jiàn)病毒樣顆粒，可能反映了細(xì)胞對(duì)病毒的防衛(wèi)作用。對(duì)照組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器形態(tài)無(wú)改變，也未見(jiàn)有病毒樣顆粒。

二、免疫電鏡觀察 免疫電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)清晰，感染細(xì)胞胞漿表現(xiàn)與透射電鏡相似，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)散在膠體金顆粒，細(xì)小的膠體金顆粒呈分散分布，也有膠體金顆粒呈簇狀附著于病毒樣顆粒鄰近，提示胞漿中可能有HCV NS5抗原存在（圖1）。有的胞漿內(nèi)見(jiàn)電子密度大的金標(biāo)顆粒，吸附于病毒樣顆粒上，病毒樣顆粒約為60μm（圖2）。對(duì)照1組細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)病毒樣顆粒，對(duì)照2組細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)病毒樣顆粒，但無(wú)膠體金顆粒黏附。

圖1 胞漿內(nèi)散在膠體金及病毒顆粒

圖2 膠體金顆粒附著于病毒表面

三、感染細(xì)胞HCV的存在 在培養(yǎng)21天時(shí)，可在全血清組的細(xì)胞內(nèi)和上清液中間斷測(cè)得HCV RNA正鏈；在補(bǔ)體滅活組、CD16 McAb組細(xì)胞內(nèi)和上清液中均未檢測(cè)到（表1、圖3）。感染前培養(yǎng)液及感染后最后留取的洗液檢測(cè)均為陰性。在培養(yǎng)21天時(shí)僅在全血清組的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到2次HCV RNA負(fù)鏈，其余組均為陰性；各組培養(yǎng)上清中均未測(cè)到病毒核酸（表 2、圖 4）。在全血清組可見(jiàn)到 NS3、NS5、C 區(qū)蛋白陽(yáng)性信號(hào)，表達(dá)于胞漿中（圖5），其余各組未見(jiàn)表達(dá)。

表1 細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清液HCV RNA正鏈的存在

表2 細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)上清液HCV RNA負(fù)鏈的存在

圖3 細(xì)胞內(nèi)HCV RNA正鏈的存在

圖4 細(xì)胞內(nèi)HCV RNA負(fù)鏈的存在

圖5 全血清組細(xì)胞病毒蛋白的表達(dá)（ABC，×100）

討 論

關(guān)于HCV顆粒形態(tài)，目前以日本Kaito的報(bào)道比較可信[8]。他們用兔抗HCV膜蛋白多克隆抗體為一抗，膠體金標(biāo)記羊抗免IgG為二抗的間接免疫電鏡技術(shù)，首次較清楚地顯示了HCV形態(tài)。他們描述HCV直徑為55～65nm，但陳良標(biāo)等根據(jù)論文照片提供的標(biāo)尺測(cè)量，病毒的實(shí)際大小是：含包膜的完整病毒直徑為100～115nm，內(nèi)含直徑55～65nm圓球形核心或核殼體，核殼體表面6nm長(zhǎng)的細(xì)釘狀突起，可能是病毒核殼體的子粒結(jié)構(gòu)。本研究參照國(guó)外學(xué)者用HCV感染體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法，對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。我們采用電子顯微鏡技術(shù)直接觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)HCV顆粒及細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變，感染后的細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)存在許多病毒顆粒樣結(jié)構(gòu)，核心直徑約為50nm左右，有明確的外膜和棘突，完整病毒顆粒直徑約100nm左右。進(jìn)行間接免疫電鏡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)病毒外膜有膠體金顆粒特異性標(biāo)記，證明所見(jiàn)確為HCV顆粒。這也是判定HCV感染滋養(yǎng)層細(xì)胞是否成功的一個(gè)可靠標(biāo)準(zhǔn)。

近年來(lái)，病毒感染中的ADE作用越來(lái)越受到人們的重視。所謂ADE作用指抗體依賴的感染增強(qiáng)作用，即特異性抗體對(duì)病毒感染有促進(jìn)作用。一般來(lái)說(shuō)，機(jī)體產(chǎn)生的病毒抗體或者對(duì)病毒有中和及抵抗作用，或者是一些無(wú)中和作用的抗體，ADE則主要表現(xiàn)在有特異性抗體存在的情況下，病毒在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中數(shù)量增多和（或）病毒感染的動(dòng)物癥狀加重或出現(xiàn)早死現(xiàn)象，從而引起疾病的進(jìn)展、導(dǎo)致疾病的進(jìn)一步惡化及對(duì)疫苗的應(yīng)用產(chǎn)生明顯的影響。此時(shí)抗體多在中度水平或亞中和滴度水平與病毒形成病毒-抗體復(fù)合物，易感細(xì)胞具有Fc受體（FcR）或補(bǔ)體受體（CR）。最初ADE的發(fā)現(xiàn)僅僅局限于抗體，隨后發(fā)現(xiàn)不僅抗體而且抗體及補(bǔ)體的復(fù)合物，甚至單純補(bǔ)體同樣有增強(qiáng)作用。故現(xiàn)在該定義實(shí)際上為一種泛指的、與補(bǔ)體及抗體相關(guān)的、增強(qiáng)病毒感染的作用。

經(jīng)血液或血制品傳播是HCV的主要傳播途徑，但在HCV感染者中只有約50%的人有血及血制品暴露史或其它可確認(rèn)的傳染途徑，進(jìn)一步研究表明還存在其它非經(jīng)血液傳播途徑。隨著對(duì)血制品檢測(cè)的加強(qiáng)及檢測(cè)技術(shù)的提高，HCV經(jīng)輸血傳播的發(fā)生率已大大降低[9]，而對(duì)HCV存在的母嬰傳播途徑開(kāi)始重視起來(lái)。我們?cè)脽晒舛縋CR技術(shù)檢測(cè)HCV感染孕婦羊水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羊水中HCV RNA陽(yáng)性率極低，僅為5.9%。提示羊水傳播不是HCV母嬰傳播的主要途徑[10]。從早期接觸、長(zhǎng)期持續(xù)接觸等特點(diǎn)分析，理論上講HCV經(jīng)胎盤(pán)感染的可能性最大。

近年來(lái)，有關(guān)IgG穿越胎盤(pán)具體機(jī)制的研究取得了很大的進(jìn)展。在胎盤(pán)絨毛組織中FcγRⅢ（CD16）僅分布于胎盤(pán)屏障的最外層，即滋養(yǎng)層細(xì)胞層。推測(cè)IgG穿越胎盤(pán)屏障通過(guò)如下分子機(jī)制模式：即由滋養(yǎng)層細(xì)胞上的FcγRⅢ介導(dǎo)IgG最初的內(nèi)吞活動(dòng)，在酸化內(nèi)吞體中，IgG可從受體中釋放，釋放的IgG與位于內(nèi)吞體表面的hFcRn特異性結(jié)合，通過(guò)胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)作用而至合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞堿性一側(cè)，IgG從hFcRn上解離，進(jìn)入毛細(xì)血管內(nèi)皮，由位于毛細(xì)血管內(nèi)皮上的FcγRⅡ介導(dǎo)，最終進(jìn)入胎兒血液[11，12]。

已有報(bào)道表明，在母體內(nèi)的HIV-1病毒與其抗體形成復(fù)合物，然后由滋養(yǎng)層細(xì)胞表面的FcγR介導(dǎo)復(fù)合物內(nèi)化，從而導(dǎo)致胎盤(pán)細(xì)胞的病毒感染，機(jī)制屬于經(jīng)典的ADE形式之一[13]。因此，HCV的母嬰傳播很可能與之相似。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)，在HCV感染滋養(yǎng)層細(xì)胞的過(guò)程中存在ADE現(xiàn)象。而缺乏補(bǔ)體或者應(yīng)用CD16單克隆抗體則明顯影響HCV進(jìn)入滋養(yǎng)層細(xì)胞，免疫組化實(shí)驗(yàn)不能發(fā)現(xiàn)HCV NS5、NS3及C區(qū)抗原的表達(dá)，說(shuō)明抗體和補(bǔ)體均參與HCV的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，但是兩者的主次關(guān)系未明，也可能是單獨(dú)的2種ADE途徑。在全血清感染細(xì)胞檢出HCV RNA負(fù)鏈，說(shuō)明HCV能在滋養(yǎng)層細(xì)胞中復(fù)制，ADE可能起了增強(qiáng)作用。最近有關(guān)ADE研究結(jié)果表明，病毒經(jīng)過(guò)Fc R-ADE進(jìn)入細(xì)胞，可以通過(guò)抑制抗病毒基因的表達(dá)而增強(qiáng)復(fù)制，這也屬于增強(qiáng)的感染結(jié)果。HCV感染細(xì)胞后21天在細(xì)胞內(nèi)外均不能檢出HCV RNA正、負(fù)鏈。由于患者的抗體僅僅是定量檢測(cè)，所以本實(shí)驗(yàn)中HCV抗體滴度與HCV的ADE現(xiàn)象關(guān)系不明確，而且參與ADE的補(bǔ)體種類也有待進(jìn)一步查明。滋養(yǎng)層細(xì)胞也并非HCV的靶細(xì)胞，HCV感染及復(fù)制均較困難。因而我們推測(cè)，HCV宮內(nèi)感染存在同樣的分子機(jī)制，其感染滋養(yǎng)層細(xì)胞不需要已知HCV感染特異性靶受體（CD81分子和LDLR分子）的介導(dǎo)，而僅需FcγRⅢ受體的非特異性介導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了我們的科研課題設(shè)想。

ADE給HCV疫苗研制帶來(lái)了新的研究課題[14]。HCV進(jìn)入滋養(yǎng)層細(xì)胞時(shí)ADE的準(zhǔn)確分子機(jī)制，以及如何經(jīng)過(guò)內(nèi)化作用跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)入細(xì)胞后是否抑制宿主抗病毒基因的表達(dá)等，均有待進(jìn)一步深入研究闡明。

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