周 耀 李思長 劉 毓 王雙雙

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)·長沙·410128）

顯齒蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)為葡萄科、蛇葡萄屬木質(zhì)藤本植物,主要分布于廣東、廣西、云南、貴州、湖南、湖北、江西、福建等省區(qū)[1],為民間習(xí)用草藥之一。據(jù)記載[2],該藥性涼,味甘淡,具有清熱解毒之功效,主治黃疸型病毒性肝炎、風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、癰瘡等癥。顯齒蛇葡萄的愈傷組織誘導(dǎo)少見報道。本文以顯齒蛇葡萄不同的部位為外植體,研究其在不同基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑以及培養(yǎng)條件下愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng),確定愈傷組織誘導(dǎo)和增殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

引種自湖南綏寧縣。選取健壯植株中上部外圍生長旺盛的幼莖作為供試材料。

1.1.1 外植體的選取

莖尖：取3cm左右長的帶頂芽莖段,在解剖鏡下逐層去除幼葉,切取0.12～0.13mm左右大小的莖尖分生組織。

帶芽莖段：將發(fā)育良好的幼嫩莖段去除頂芽與葉片,切成長約1cm的帶芽莖段。

葉片:選取黃綠色幼葉,去除幼葉邊緣,切成1cm2左右的小塊。

葉柄：選取較幼嫩的成熟葉片的葉柄,頂端帶少量葉片,長約1cm。

1.1.2 繼代培養(yǎng)材料的選取

生長良好的初代愈傷組織。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

以MS、B5為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的2，4-D，6-BA，NAA，KT 等植物生長調(diào)節(jié)劑，并添加不同濃渡的椰子汁、蔗糖，pH值為5.8～6.0。

繼代培養(yǎng)基：不同濃度梯度的NAA與2，4-D組合。

1.2.2 外植體的消毒、接種與培養(yǎng)條件

流水沖洗幼枝2～3h,洗凈后在超凈工作臺上用70%酒精快速處理30s，用無菌水沖洗一次，再用0.1%升汞（HgCl2）浸泡：嫩葉浸泡 5min，莖段、葉柄浸泡7～8min，無菌水沖洗多次；接種在不同的培養(yǎng)基上；培養(yǎng)條件：溫度為25℃～26℃，光照強(qiáng)度開始為 250～300Lx、 后轉(zhuǎn)為 2000～3000Lx， 光照時間（14h/d）,相對濕度為 75%～85%。

2 研究內(nèi)容

①不同培養(yǎng)基愈傷組織的誘導(dǎo)；②不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)；③葉片正、背面朝上對愈傷組織的誘導(dǎo)；④不同光照強(qiáng)度下愈傷組織的誘導(dǎo)；⑤不同光照時間愈傷組織的誘導(dǎo)；⑥添加不同椰子汁用量愈傷組織的誘導(dǎo)；⑦不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合的愈傷組織誘導(dǎo)；⑧不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的繼代培養(yǎng)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同培養(yǎng)基對顯齒蛇葡萄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將顯齒蛇葡萄幼葉接種在含有2，4-D 2mg/L+KT0.2mg/L+100ml/L椰子汁+蔗糖2%+瓊脂0.7%的不同基本培養(yǎng)基上（MS、B5），每種處理10瓶，每瓶外植體5塊，培養(yǎng)15d，觀察統(tǒng)計出愈率與愈傷生長情況（表1）。

從表1可知，MS培養(yǎng)基對顯齒蛇葡萄幼葉愈傷組織的出愈率最高（90%）、長勢好，B5培養(yǎng)基的出愈率最低（65%）、生長情況也最差。

MS培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的濃渡高，能滿足愈傷組織對礦物質(zhì)營養(yǎng)的要求，愈傷組織生長快，同時銨鹽和銷酸鹽的含量高，且比例適合，不需要添加更多的有機(jī)附加物；改良MS培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基的配方中把無機(jī)鹽的含量減少了一半配制而成，出愈率及愈傷生長自然隆低；銨可能對不少培養(yǎng)物的生長有抑制作用，B5中銨鹽濃度較低，可能反而較大地限制了顯齒蛇葡萄愈傷的形成和生長。

表1 不同基本培養(yǎng)基對愈傷組織的影響Table 1 The effect on callus induction ofdifferent basic media

3.2 不同外植體愈傷誘導(dǎo)效果比較

將不同外植體（葉片、葉柄、莖段和莖尖）分別接種在 MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+100ml/L 椰子汁+蔗糖2%+瓊脂0.7%的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每種處理10瓶，7～12d外植體開始萌動，并隨后產(chǎn)生愈傷組織，結(jié)果見表2。

表2 不同外植體的愈傷誘導(dǎo)效果比較Table 2 The induction ofcallus from different explant

從表2可知，葉片外植體的出愈率高達(dá)93%，要明顯高于葉柄的（85.7%）和莖段的（81.2%），且愈傷生長狀況較好。

葉片外植體出愈率高的原因可能是因?yàn)橛啄廴~片的細(xì)胞分化程度較低，因而具有較大的脫分化潛力；且與培養(yǎng)基接觸面積大，對添加的植物生長調(diào)節(jié)劑更為敏感。莖尖外植體未見愈傷產(chǎn)生，可能有兩個原因：一是試驗(yàn)操作有誤，如莖尖剝離時去掉了頂端分生組織；二是因?yàn)槿〔臅r間是秋天，已近休眠時間。

3.3 葉片正背面朝上對顯齒蛇葡萄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將切好的葉片以正面朝上和背面朝上，分別接種于 MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+100ml/L 椰子汁+蔗糖2%+瓊脂0.7%的培養(yǎng)基上，每處理5瓶，弱光培養(yǎng)15d，結(jié)果見表3。

表3 葉片正背面朝上對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 The effect on callus induction ofleafin different side

由表3可知，正面朝上葉片的出愈率為93.3%，明顯高于背面朝上的（60%）處理，且啟動時間短。這可能與葉片的結(jié)構(gòu)有關(guān)。顯齒蛇葡萄正面朝上，葉片背面氣孔較多，且靠近疏松的海綿組織，利于吸收，因此葉片背面接觸培養(yǎng)基培養(yǎng)更為適宜。同時還發(fā)現(xiàn)，葉片背面朝上接種產(chǎn)生的愈傷組織褐色較明顯。

3.4 光照強(qiáng)度對齒蛇葡萄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將接種的葉片在25℃恒溫培養(yǎng)室進(jìn)行光照強(qiáng)度分組試驗(yàn)，設(shè)以下三種光照強(qiáng)度：①2000～2500Lx：每層培養(yǎng)架用4支40W日光燈照明，直射光；②1000～1250Lx：每層培養(yǎng)架用2支40W日光燈照明，直射光；③250～350Lx：放在另外一層不開燈的架子上，僅靠旁邊培養(yǎng)架上的散射光。20d后統(tǒng)計結(jié)果（表4）。

表4 不同光照強(qiáng)度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 4 The effect on callus induction of different light intensity

由表4可知，光照強(qiáng)度對顯齒蛇葡萄葉片愈傷組織誘導(dǎo)效果的影響較顯著：在暗培養(yǎng)下，愈傷誘導(dǎo)率最高（94.2%），但愈傷質(zhì)地疏松；在弱光（250～350Lx）下出愈率最高達(dá)92.5%，愈傷呈淺綠色，質(zhì)地致密，質(zhì)量好；當(dāng)光強(qiáng)達(dá)2000～2500Lx時，出愈率急劇下隆至52%，且質(zhì)地疏松。因此，顯齒蛇葡萄愈傷誘導(dǎo)以弱光誘導(dǎo)為最佳。

3.5 光照時間對顯齒蛇葡萄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將葉片接種在MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+100ml/L椰子汁+蔗糖2%+瓊脂0.7%的培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度25℃、光照強(qiáng)度250～350Lx、培養(yǎng)瓶中葉片距光源約400mm的條件下，設(shè)置光照時間梯度 10h/d、12h/d、14h/d 和 16h/d， 每處理 13 瓶，15d后統(tǒng)計結(jié)果（表5）。

表5 不同光照時間對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 5 The effect on callus induction ofdifferent illumination time

由表5可見，光照時間為14h/d時外植體出愈率最高，同時愈傷生長狀況最好；隨著光照時間縮短，出愈率下降較明顯；但光照時間高達(dá)16h/d時，則容易出現(xiàn)愈傷褐化現(xiàn)象。綜合表4和表5發(fā)現(xiàn)，較長時間弱光條件利于顯齒蛇葡萄葉片愈傷的誘導(dǎo)，可能是因?yàn)榭烧T導(dǎo)愈傷形成的植物激素的產(chǎn)生依賴于光的存在[4]。

3.6 椰子汁用量對顯齒蛇葡萄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基中加入椰子汁，常能有效提高愈傷組織誘導(dǎo)率。將切好的葉片接種在MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+蔗糖2%+瓊脂0.7%的培養(yǎng)基上，依次調(diào)節(jié)椰子汁的用量，每處理3瓶，15 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果（表6）。

表6 不同椰子汁用量對愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 6 The effectoncallus inductionofcoconutmilk concentration

從表6可看出，椰子汁用量為100ml/L時為最合適用量，該處理的出愈率最高，用量過多或過少時，出愈率均有所下降。

3.7 不同植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對顯齒蛇葡萄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在獲得最佳培養(yǎng)基上，以嫩葉為外植體，設(shè)置4 個因素分別為 6-BA、2，4-D、NAA、KT 根據(jù) 5 因素 4 水平設(shè)計 L16（54）（表7），15d 后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果，正交試驗(yàn)[5～7]，結(jié)果見表8。

表7 正交因素表Table 7 The table of orthogonal experiment

表8 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 8 The results of orthogonal experiment

從表8中可看出，通過正交實(shí)驗(yàn)得出植物生長調(diào)節(jié)劑影響因子排序?yàn)椋?-BA〉KT〉NAA〉2，4-D；最佳組合為 6-BA （1.5mg/L）+KT(0.15mg/L)+NAA(0.2mg/L)+2，4-D（2mg/L）。將最佳實(shí)驗(yàn)組合重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。同時發(fā)現(xiàn)高濃度的6-BA容易導(dǎo)致愈傷出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

3.8 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對顯齒蛇葡萄繼代培養(yǎng)的影響

在獲得初代培養(yǎng)最佳基本培養(yǎng)基上，生長良好的初代愈傷作為繼代培養(yǎng)的材料，以MS為基本培養(yǎng)基，分別設(shè)置不同的植物生長調(diào)節(jié)劑NAA和2，4-D的組合，添加100ml/L椰子汁+蔗糖2%+瓊脂0.7%，試驗(yàn)重復(fù)三次。繼代培養(yǎng)15d天后，統(tǒng)計試驗(yàn)結(jié)果（表9）。

愈傷組織繼代培養(yǎng)所用的植物生長調(diào)節(jié)劑最佳組合為：1.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D。繼代培養(yǎng)出的愈傷組織呈團(tuán)塊狀，黃綠色，結(jié)構(gòu)較致密，增殖率較高。

據(jù)報道[8]，培養(yǎng)物褐變是由于培養(yǎng)物含有的豐富多酚化合物在多酚氧化酶的作用下氧化所致，在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑，對防止某些植物培養(yǎng)物的褐變具有一定的效果。

表9 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對繼代培養(yǎng)的影響Table 9 The effect on genetated culture of different hormone combination

3 結(jié)論

顯齒蛇葡萄以葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織明顯優(yōu)于其它外植體，且以葉片正面向上為佳。經(jīng)過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出最佳的培養(yǎng)條件是：在培養(yǎng)基MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L KT+0.2mg/L NAA+2mg/L 2,4-D+100ml/L椰子汁上，光照強(qiáng)度為250～350Lx，每日光照時間為14h，出愈率最高，且愈傷組織生長狀況最好。

1 中國科學(xué)院植物研究所，中國高等植物圖鑒（二冊）補(bǔ)編[M].北京：科學(xué)出版社，1883：349～356.

2 鄭小紅，劉金龍，向班貴，等.顯齒蛇葡萄新品種——綠鳳[J].園藝學(xué)報，2004，31（5）：701

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