蔣光，楊遠(yuǎn)

支氣管哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，反復(fù)炎癥刺激可引起組織損傷及后續(xù)的組織結(jié)構(gòu)的改變即氣道重塑[1]，其確切發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚。糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase3β，GSK-3β）是真核生物中廣泛存在的絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種細(xì)胞過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以參與核因子 kappa B（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路的調(diào)節(jié)。文獻(xiàn)[2]報(bào)道 GSK3β 主要通過調(diào)節(jié) NF-κB 核轉(zhuǎn)位及亞基 p65 磷酸化而影響核因子的活性，而 NF-κB又是多向調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloprotease-9，MMP-9）基因[3]，是重要的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，它們在許多疾病生理病理過程中起重要作用，近年研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β 具有逆向調(diào)節(jié)心肌肥厚[4]、氣道平滑肌肥大增生[5]的作用，Bentley 等[6]發(fā)現(xiàn)急性支氣管哮喘模型的氣道平滑肌細(xì)胞肥大、增生，上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中失活的磷酸化 GSK-3β（pGSK-3β）含量增加。全肺 pGSK-3β 增加，GSK-3β 活性降低，說明 GSK-3β 磷酸化、失活促進(jìn)氣道平滑肌重塑。有關(guān) GSK-3β 在慢性哮喘氣道重塑過程中的表達(dá)及作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在利用卵蛋白致敏和激發(fā)的慢性支氣管哮喘小鼠模型，探討支氣管哮喘氣道重塑形成過程中 GSK-3β、NF-κB 和mmP-9 的表達(dá)情況及相互關(guān)系，為氣道重塑的發(fā)生機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

清潔級雄性 BALB/c 小鼠 16 只，6 周齡，體重 16～20 g，許可證號：SCXK（蘇）2007-0001，購于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；V 級雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購自美國 Sigma 公司；兔抗磷酸化糖原合成酶激酶-3β（Ser9）多克隆抗體購自美國 Cell signal 公司；鼠抗 NF-κB p65 單克隆抗體購自美國 Santa Cruz 公司；兔抗mmP-9 多克隆抗體購自美國 Santa Cruz 公司；β-actin 購自美國 Santa Cruz 公司 。SB-15347 垂直電泳儀購自美國 GE 公司；XXOV-450 半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad 公司；硝酸纖維素膜購自美國 Bio-Rad 公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑（ECL）購自美國 GE 公司；Cymentre 2000 柯達(dá)活體成像儀購自美國 Kodak公司。

1.2 方法

1.2.1 慢性支氣管哮喘小鼠模型制備 將小鼠隨機(jī)分為2 組：哮喘組和對照組，每組 8 只。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，采用卵蛋白致敏和激發(fā)法[7]建立支氣管哮喘小鼠模型。哮喘組于第0、14 天腹腔注射 OVA 10 μg + 氫氧化鋁 2 mg 的生理鹽水懸液 0.1 ml，第21 天開始以 2.5%OVA 霧化激發(fā)，30min/d，每周 3 d，共 6 周；對照組全部以生理鹽水代替。

1.2.2 取材 2 組小鼠末次激發(fā)后 24 h 內(nèi)頸椎脫臼處死動物，迅速打開胸腔，取出左肺于 10%中性福爾馬林溶液中固定 24 h。肺標(biāo)本嚴(yán)格于垂直位石蠟包埋，切片，片厚 3 μm。右肺用 PBS 液沖洗后入 –70℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 HE 染色 取左肺組織切片行 HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察（觀察倍數(shù) 10×40）支氣管及周圍的炎性細(xì)胞浸潤情況及黏膜和平滑肌的變化。

1.2.4 pGSK-3β、NF-κB p65 和mmP-9 蛋白表達(dá)的檢測 從 –70℃低溫冰箱中取出右肺組織標(biāo)本，剪碎后，加入蛋白質(zhì)裂解緩沖液及蛋白酶抑制劑，置于玻璃勻漿器中研磨，冰上勻漿，4℃14 000×g離心 5min，取上清液，蛋白質(zhì)印跡法[8]測定蛋白質(zhì)含量。取上述上清液按上樣量 40 μg 上樣，加等體積的上樣緩沖液稀釋，經(jīng)聚丙烯酞胺變性凝膠電泳分離蛋白，采用試劑說明書提供的電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，依次加入封閉液、一抗（稀釋度 1∶1 000）、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，再經(jīng)化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)，X 光片壓片曝光。自動獲取圖片結(jié)果。相應(yīng)蛋白表達(dá)值為條帶的灰度值除以 β-actin（1∶1 000，43 KD）內(nèi)參照校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性哮喘氣道重塑模型

對照組小鼠行動敏捷，一般情況未見異常。哮喘組經(jīng)卵蛋白激發(fā)后，出現(xiàn)擦鼻，打噴嚏，呼吸急促，口唇發(fā)紺，腹部翕動，易激惹，煩躁不安，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸減慢，行動遲緩或俯伏不動。

2.2 肺組織病理學(xué)變化

光學(xué)顯微鏡下哮喘組與對照組相比，小鼠氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，黏膜下水腫，黏膜下層增寬，管腔狹窄，有時可見黏液栓堵塞，氣道上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增多，黏膜下及管周有大量炎性細(xì)胞浸潤等（圖1）。

圖1 各組小鼠的組織學(xué)染色×400（A：哮喘組；B：對照組）Figure 1 Histological staining of lung tissues of mice in each group.A: Asthma group; B: Control group.

2.3 肺組織 pGSK-3β、NF-κB 和mmP-9 的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，哮喘組 pGSK-3β、NF-κB 和mmP-9 的表達(dá)水平均高于對照組（P＜0.05），pGSK-3β 和 NF-κB 的表達(dá)呈正相關(guān)，NF-κB和mmP-9 的表達(dá)呈正相關(guān)（圖2 和表1）。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組小鼠肺組織 pGSK-3β、NF-κB 和mmP-9 表達(dá)量Figure 2 The expression levels of pGSK-3β, NF-κB andmmP-9 in lung tissues of mice were assessed by Western blotting

表1 各組小鼠肺組織 pGSK-3β、NF-κB 和mmP-9 的灰度值（±s）Table 1 Gray value of pGSK-3β, NF-κB andmmP-9 in lung tissues of mice in each group

表1 各組小鼠肺組織 pGSK-3β、NF-κB 和mmP-9 的灰度值（±s）Table 1 Gray value of pGSK-3β, NF-κB andmmP-9 in lung tissues of mice in each group

注：a表示與對照組比較P＜0.01Note: a RepresentP＜0.01 by compared with the control group.

組別 Groups pGSK-3β NF-κB mmP-9哮喘組Asthma group 0.744±0.059a 0.847±0.076a 0.645±0.066a對照組Control group 0.287±0.018 0.293±0.017 0.296±0.015

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 OVA 致敏加反復(fù)霧化激發(fā)可以成功建立小鼠哮喘氣道重塑模型類似于人類哮喘的氣道炎癥和氣道重塑的病理改變，與國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)[7]報(bào)告相似。

GSK-3 最早是作為能夠磷酸化并抑制糖原合成酶（Glycogen Synthase，GS）活性的蛋白激酶而被發(fā)現(xiàn)[9]，GSK-3 具有 2 個緊密相關(guān)的亞型GSK-3α 和 GSK-3β，新近研究表明，GSK-3β 能磷酸化多種底物，包括代謝與信號蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子等，參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和胰島素反應(yīng)等諸多方面。在受到外界刺激后，總的 GSK-3β 水平?jīng)]有改變，GSK-3βN端絲氨酸殘基（Ser9）磷酸化形成假底物覆蓋活化位點(diǎn)而使該酶活性降低，從而改變其下游成分的活性或功能[10]。人類許多疾病如糖尿病、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、炎癥等都與 GSK-3β 活性調(diào)節(jié)異常有關(guān)，因此 GSK-3β 已經(jīng)成為多種疾病治療的潛在靶點(diǎn)。

氣道重塑過程也是細(xì)胞外基質(zhì)重塑的過程，上皮下纖維化形成及氣道壁膠原的沉積增加是氣道重塑的重要病理改變，在這一過程中細(xì)胞外MMP-9 表達(dá)異常起了重要作用[11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著 pGSK-3β 增多，NF-κB活性升高，MMP-9 表達(dá)也增加，三者呈正相關(guān)。GSK-3β 磷酸化失活，NF-κB 和mmP-9 表達(dá)的異常升高參與了哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展。GSK-3β參與并促進(jìn)氣道重塑可能是通過對 NF-κB 的作用來介導(dǎo)的，由于體內(nèi) NF-κB 調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜，關(guān)于GSK-3β 和 NF-κB 之間具體的作用機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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