畢薇薇，黃若洋，劉洋

近年來，對間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）的研究越來越細致和深入，MSC 的動物及臨床試驗研究也越來越廣泛。MSC 可來源于骨髓、臍帶、脂肪、肌肉等組織，其中研究與應用較多的是自體骨髓 MSC。但由于骨髓來源的 MSC受年齡及身體狀況等因素影響，其細胞質(zhì)量和數(shù)量受到很大限制[1]。為此，本實驗嘗試在體外從人胎兒肝臟中提取 MSC 并研究其生物學特性，以期為將來 MSC 的臨床應用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 人胎兒肝臟組織來源于四平市中心醫(yī)院藥物流產(chǎn)胎兒，胎齡 2～3 個月，母親身體健康（捐獻者均簽署知情同意書）。肝功能正常，肝炎病毒標志物均為陰性。梅毒陰性，HIV 陰性。

1.1.2 主要試劑與儀器 α-MEM 培養(yǎng)液和優(yōu)等胎牛血清（FBS）購自美國 Hyclone 公司；胰蛋白酶購自美國 Gibco 公司；II 型膠原酶購自美國Sigma 公司；FITC 標記的小鼠抗人 CD34、CD44、CD105、CD13、HLA-ABC、HLA-DR 單抗購自法國 Immuntech 公司；細胞培養(yǎng)瓶購自美國 Corning公司；371 型高溫滅菌 CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo 公司；程序降溫盒購自美國 NALGENE 公司；CKX41 型倒置相差顯微鏡為日本 Olympus 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人胎兒肝臟 MSC 的分離與培養(yǎng) 無菌取出胎肝，用 PBS 沖洗數(shù)次，剪碎后用 0.25%胰酶消化后 4℃過夜。次日取出于 37℃繼續(xù)消化 5～10min，吸出細胞懸液，在剩余組織中加入 0.1%的II 型膠原酶，37℃中和 10min，消化后組織用200 目篩網(wǎng)過濾，獲得的細胞懸液 270×g離心5min，細胞沉淀用 PBS 洗 2 次。將細胞沉淀置于含 10%胎牛血清的 α-MEM 培養(yǎng)液中，吹打制備成終濃度為1×106/ml 的細胞懸液。將細胞懸液加入裝有含 10%胎牛血清的 α-MEM 培養(yǎng)液的25cm2培養(yǎng)瓶中，置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后，吸出懸浮細胞液體，更換新培養(yǎng)液；隨后 2～3 d 換液 1 次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況并拍照。待細胞生長至 10 d 左右達80%以上融合后，加入 0.25%胰蛋白酶- 0.02%EDTA（1∶1）混合液消化進行重復傳代培養(yǎng)，各代細胞依次記為P1～P10 代細胞。

1.2.2 MSC 生長曲線的測定 取生長良好的P3、P7、P10 代細胞，用 0.25%胰酶（含 1mmol EDTA）消化后，以 2×104/ml 的密度接種于 24 孔板，每孔 1 ml。每天各取 3 孔消化計數(shù)細胞，取平均值，連續(xù)培養(yǎng) 7 d。以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸，繪制細胞生長曲線。

1.2.3 MSC 表面抗原標志的測定 取生長良好的 P5 代細胞，用 0.25%胰酶（含 1mmol EDTA）消化。PBS 洗滌 2 次，制備成終濃度為1×106/ml的細胞懸液，分裝入試管中，每管 0.1 ml。分別加入 FITC 標記的小鼠抗人 CD34、CD44、CD105、CD13、HLA-ABC、HLA-DR 單抗，同時以加入α-MEM 培養(yǎng)液作為陰性對照。黑暗中孵化 15min后，上流式細胞儀檢測。

1.2.4 向成骨細胞的誘導及鑒定 取生長良好的P4 代細胞，用 0.25%胰酶（含 1mmol EDTA）消化后，以 4×104/ml 的密度接種于預置多聚賴氨酸預處理蓋玻片的 6 孔板內(nèi)。加入含有 1×10-8mol/L 地塞米松、1×10-2mol/L β-甘油磷酸鈉、1.5×10-4mol/L 維生素 C 的 α-MEM 培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)，同時以僅加入 α-MEM 培養(yǎng)液作為陰性對照，每 3 d 換液 1 次。誘導 2 周左右取出細胞爬片，進行堿性磷酸酶染色。

1.2.5 MSC 的凍存與復蘇 隨機收集生長良好的傳代細胞，取少量細胞懸浮液（約 0.1 ml）計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。加入含有 10%二甲基亞砜（DMSO）和 30%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液，裝入無菌塑料冷凍保存管（corning）放至程序降溫盒中，于 –70℃凍存 24 h 后轉(zhuǎn)入液氮保存。分別于 2 個月和 6 個月后，取出凍存管，37℃水浴復蘇細胞，臺盼藍染色檢測細胞活性。在細胞懸液中加入 α-MEM 培養(yǎng)液后離心，置于 37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 MSC 體外培養(yǎng)與形態(tài)學觀察

原代細胞接種 3 d 后可見少量貼壁細胞，細胞大小形態(tài)不均，呈圓形、纖維樣或內(nèi)皮細胞樣，均為單個細胞（圖1A）；6 d 后細胞開始快速增長，形成多處快速生長的細胞集落，集落內(nèi)細胞多為較寬的梭形細胞，呈漩渦狀或放射狀平行排列，且隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞集落伸展增大。原代培養(yǎng)至 11 d 左右時細胞達 80%～90%融合，此時細胞排列緊密，多呈纖維樣，而內(nèi)皮樣細胞少見，圓形細胞消失（圖1B）。細胞傳代培養(yǎng) 2～3 代后維持纖維樣形態(tài)，較緊密。

圖1 人胎兒肝臟 MSC 體外原代培養(yǎng)的形態(tài)學觀察（A：培養(yǎng)第3 天時細胞形態(tài)，倒置相差顯微鏡×100；B：培養(yǎng)第11 天時細胞形態(tài)，倒置相差顯微鏡×40）Figure 1 The morphology observation of human fetal liver MSC cultured in vitro.A: The morphology of human fetal liver MSC cultured for 3 days, inverted phase contrast microscope×100; B: The morphology of human fetal liver MSC cultured for 11 days, inverted phase contrast microscope×40.

2.2 MSC 生長曲線分析

傳代細胞生長較原代細胞要快，一般 4～5 d左右即能達到 90%以上融合。觀察 P3、P7、P10代細胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)具有以下共同特征：傳代培養(yǎng)的潛伏期約為24～48 h，對數(shù)增殖期約為3～4 d，對數(shù)增殖期后第5～6 天進入平臺期（圖2）。

圖2 人胎兒肝臟 MSC 體外傳代培養(yǎng)細胞生長曲線Figure 2 Growth curve of human fetal liver MSC subcultured in vitro

圖3 人胎兒肝臟 MSC 表面抗原標志的流式細胞術(shù)檢測Figure 3 Detection of antigen markers on human fetal liver MSC surface by flow cytometry

2.3 MSC表面抗原標志檢測

流式細胞儀檢測顯示，MSC 表面 CD34、HLA-DR 均呈陰性表達，CD44、CD105、CD13 均呈陽性表達，HLA-ABC 呈弱陽性表達（圖3）。

2.4 成骨誘導鑒定

成骨誘導培養(yǎng) 2 周后，進行堿性磷酸酶染色，可見誘導后細胞的細胞核染成均一的淡藍色，陰性對照則未見細胞染色（圖4）。證實人胎兒肝臟來源的 MSC 有成骨分化潛能。

圖4 人胎兒肝臟 MSC 體外成骨誘導的堿性磷酸酶染色檢測（倒置相差顯微鏡×400）Figure 4 Detection of human fetal liver MSC induced into Osteogenesis in vitro by alkaline phosphatase staining (Inverted phase contrast microscope×400)

2.5 細胞凍存及復蘇生長特性分析

臺盼藍染色計數(shù)復蘇后細胞存活率達 90%以上，倒置相差顯微鏡下觀察復蘇后細胞增殖能力較強，與未凍存?zhèn)鞔毎啾染哂邢嗤纳L特性。

3 討論

體內(nèi)、外實驗證明在不同的誘導條件下，MSC可分化為多種細胞，并可分泌多種趨化因子和生長因子等[2]，能促進細胞的生長、增殖并介導細胞的遷移[3-4]，具有廣泛潛在的臨床應用價值。此外，MSC 還易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達，其攜帶的外源基因表達具有組織特異性，可定位于缺陷組織，因此 MSC 的分離培養(yǎng)及擴增具有重要意義。胚胎組織中 MSC 的含量相對較高，且具有更強的增殖分化潛能；另外，由于胚胎處在宮內(nèi)發(fā)育階段時，受環(huán)境影響較小，因而由環(huán)境因素所引起的基因突變也較少；同時胚胎組織細胞的免疫原性及免疫活性也較成體組織更弱，這也存在著明顯的優(yōu)勢。胚胎肝臟在人孕 5 周開始造血，在胚胎造血期間，機體需要間質(zhì)組織及其分泌的大量細胞因子以支持并促進造血和血細胞分化[5]，因此早期的胎肝中含有豐富的 MSC。

肝臟組成復雜，人們通常使用經(jīng)腹主動脈或臍靜脈灌流消化法[6]（胰蛋白酶或膠原酶）先離散細胞，再通過淋巴細胞分離液或進行密度梯度離心獲取單個核細胞[7]。此類方法不僅操作復雜，而且易污染。本研究采用雙酶消化法從人胎肝中分離獲取MSC，結(jié)果顯示胎肝來源的 MSC 在生長周期、表面抗原標志[8]、免疫學特性以及向脂肪細胞和成骨細胞分化能力等方面與以往研究的骨髓來源的MSC 相類似。胎齡越小，由于肝臟 MSC 占肝組織各種細胞的比例越大，越容易分離、純化。但有研究表明，不同來源的 MSC 所分泌的細胞因子也不完全相同[9]。

目前，肝干細胞參與肝臟生長發(fā)育與再生的觀點已被廣泛接受，利用肝干細胞進行細胞移植與生物人工肝治療各種終末期肝病也被認為是最有前途的方法之一。但有關(guān)肝干細胞活化、分離培養(yǎng)、篩選及鑒定等方法尚未成熟，還有待進一步發(fā)展和完善。

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