張衛(wèi)星，劉彥隆，于洋，龔琦，李校堃，林紹強

角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）又稱成纖維細胞生長因子 7，屬于成纖維細胞生長因子家族，是從人胚胎肺成纖維細胞培養(yǎng)上清中分離純化獲得的一種相對分子質量為26 000～28 000 的單鏈多肽，這種細胞因子具有促進小鼠角質細胞有絲分裂的作用，因此被命名為角質細胞生長因子。隨后的一系列研究證明這種細胞因子的靶細胞為上皮細胞，分泌細胞為各種來源的間質細胞，其作用是促進上皮細胞的增殖和生長。近年來的研究表明，KGF 具有廣泛的生物學活性，能促進多種細胞中 DNA 的合成，與多種組織、器官的形成和發(fā)育有關，在胃腸[1]、口腔黏膜[2]、胸腺[3]、肺[4]等多種器官的損傷修復中發(fā)揮重要作用。在胚胎胸腺器官培養(yǎng)實驗中，KGF 可誘導胸腺上皮祖細胞和成熟胸腺上皮細胞增殖[5]；胚胎期 KGF 受體缺失小鼠由于胸腺上皮細胞缺乏增殖和分化能力而表現(xiàn)出明顯的胸腺生成障礙[6]。最近有報道稱，KGF 可以明顯促進老齡鼠萎縮胸腺的增生[7]，同時KGF 也可以促進正常小鼠胸腺和接受骨髓移植后小鼠胸腺的增生[3]。研究表明 KGF 主要通過與胸腺上皮細胞表面的 KGF 受體結合而促進胸腺上皮細胞增殖，最終導致胸腺增生。但由于胸腺上皮細胞較難分離及其在體外存活時間較短，因此KGF 促胸腺上皮細胞增殖的分子機制以及信號途徑尚不清楚。1C6 細胞和 4C18 細胞分別是鼠胸腺上皮髓質和皮質來源的細胞系，在此我們擬利用體外細胞培養(yǎng)方法觀察 KGF 對 1C6 細胞和 4C18細胞的促增殖作用，為探求 KGF 促胸腺增殖的分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 鼠胸腺上皮髓質來源的 1C6 細胞、皮質來源的 4C18 細胞和鼠腹腔巨噬細胞來源的 RAW 細胞均由中國科學院動物研究所提供。

1.1.2 試劑 KGF 由吉林農(nóng)業(yè)大學提供；DMEM培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；噻唑藍（MTT）購自北京賽百盛生物工程公司；二甲基亞砜（DMSO）和牛血清白蛋白（BSA）購自美國 Sigma 公司；10%胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 體外細胞培養(yǎng) 將 1C6 細胞、4C18 細胞和 RAW 細胞分別置于 DMEM 培養(yǎng)液（含 10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 鏈霉素）中，在 37℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，2～3 d 傳代 1 次。

1.2.2 細胞增殖活性測定 采用 MTT 法測定細胞增殖活性。實驗分 KGF 處理組和對照組，每組各設 4 個復孔。分別將 1C6 細胞、4C18 細胞和RAW 細胞以 4×103/孔的密度接種于 96 孔板，待細胞貼壁后，KGF 處理組分別加入含 25、50、100、200、400、800 ng/ml KGF 的完全培養(yǎng)液 200 μl，對照組加入不含 KGF 的完全培養(yǎng)液 200 μl；同時以加入 200 μl 完全培養(yǎng)液作為空白孔。各組細胞經(jīng)不同處理后分別繼續(xù)培養(yǎng) 24、48 和 72 h，培養(yǎng)結束后每孔加入 20 μl MTT（5 mg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入 200 μl DMSO，振蕩 10min，使藍紫色結晶充分溶解，在酶標儀上測定各孔波長 492 nm處吸光度（A）值。按下列公式計算細胞增殖率：細胞增殖率（%）=（實驗孔平均A值 － 對照孔平均A值）/對照孔平均A值×100%，并繪制細胞增殖率曲線。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用 SPSS13.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗組與對照組檢測結果的比較采用 Student’st檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KGF 對 1C6 細胞的促增殖作用

不同濃度（25、50、100、200、400、800 ng/ml）的 KGF 分別作用 1C6 細胞 24 h（圖1A）、48 h（圖1B）和 72 h（圖1C），MTT 法測定A492值并繪制細胞增殖率曲線，結果顯示在低濃度（＜200 ng/ml）時，細胞增殖率隨 KGF 濃度的增加不斷升高；當 KGF 濃度為200 ng/ml 時，細胞增殖率達到最高值；而在高濃度（＞ 200 ng/ml）時，細胞增殖率隨 KGF 濃度的增加又逐漸下降。

圖1 不同濃度（25、50、100、200、400、800 ng/ml）KGF 作用不同時間對 1C6 細胞的促增殖作用（A：不同濃度 KGF 作用 1C6細胞 24 h；B：不同濃度 KGF 作用 1C6 細胞 48 h；C：不同濃度KGF 作用 1C6 細胞 72 h）Figure 1 Proliferative effect on 1C6 cells affected by different concentrations of KGF (25, 50, 100,200, 400, 800 ng/ml) for different time.A: 1C6 cells were affected by different concentrations of KGF for 24 h; B: 1C6 cells were affected by different concentrations of KGF for 48 h; C: 1C6 cells were affected by different concentrations of KGF for 72 h.

與對照組比較，濃度為100、200、400 ng/ml 的KGF 分別作用 24、48 和 72 h 對 1C6 細胞均具有明顯的促增殖作用（均P＜0.05）。

2.2 KGF 對 4C18 細胞的促增殖作用

不同濃度（25、50、100、200、400、800 ng/ml）的 KGF 分別作用 4C18 細胞 24 h（圖2A）、48 h（圖2B）和 72 h（圖2C），MTT 法測定A492值并繪制細胞增殖率曲線，結果顯示在低濃度（＜100 ng/ml）時，細胞增殖率隨 KGF 濃度的增加不斷升高；當 KGF 濃度為100 ng/ml 時，細胞增殖率達到最高值；而在高濃度（＞ 100 ng/ml）時，細胞增殖率隨 KGF 濃度的增加又逐漸下降。

圖2 不同濃度（25、50、100、200、400、800 ng/ml）KGF 作用不同時間對 4C18 細胞的促增殖作用（A：不同濃度 KGF 作用 4C18 細胞 24 h；B：不同濃度 KGF 作用 4C18 細胞 48 h；C：不同濃度 KGF 作用 4C18 細胞72 h）Figure 2 Proliferative effect on 4C18 cells affected by different concentrations of KGF (25, 50, 100, 200, 400, 800 ng/ml)for different time.A: 4C18 cells were affected by different concentrations of KGF for 24 h; B: 4C18 cells were affected by different concentrations of KGF for 48 h; C: 4C18 cells were affected by different concentrations of KGF for 72 h.

與對照組比較，濃度為50、100、200、400 ng/ml的 KGF 分別作用 24、48 和 72 h 對 4C18 細胞均具有明顯的促增殖作用（均P＜0.05）。

2.3 KGF 對 RAW 細胞的促增殖作用

不同濃度（25、50、100、200、400、800 ng/ml）的 KGF 分別作用 RAW 細胞 24、48 和 72 h，MTT 法測定A492值并繪制細胞增殖率曲線，結果顯示 KGF 對 RAW 細胞均無明顯促增殖作用。

3 討論

KGF 作為一種有絲分裂原能特異性地促進上皮細胞的增殖和分化[8]，本實驗結果證明 KGF 對胸腺上皮髓質和皮質來源的 1C6 細胞和 4C18 細胞均具有明顯的促增殖作用。有研究報道，KGF 主要通過與胸腺上皮細胞表面 KGF 受體的結合而促進老齡鼠萎縮胸腺以及理化因素所致小鼠萎縮胸腺的增生[7,9]。胸腺上皮構成了胸腺細胞賴以生存的微環(huán)境，是 T 細胞發(fā)育和成熟的主要場所，為骨髓來源的胸腺前體細胞提供了足夠的生存空間，因此胸腺上皮細胞的增生，擴大了 T 細胞的生存環(huán)境，促進胸腺細胞生成增加，導致胸腺的增生[10]。但是由于胸腺上皮細胞分離技術尚未成熟及其體外生存時間很短，所以至今為止 KGF 與KGF 受體信號途徑對胸腺促增殖作用的具體機制，以及該途徑中上游或下游的作用因子尚未闡明。本實驗結果表明 KGF 對胸腺上皮髓質和皮質來源的 1C6 細胞和 4C18 細胞均具有明顯的促增殖作用，但是對腹腔巨噬細胞來源的 RAW 細胞無促增殖作用，表明 KGF 可特異性對 1C6 和 4C18細胞發(fā)揮促增殖作用。這將為下一步探討 KGF 促進胸腺增生的分子機制和信號途徑提供可能性。

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