張秀敏，史琪琪，李增山，葉菁，王軍偉，林慧，曲萍，胡沛臻，隋延仿

腫瘤多肽疫苗因其具有化學性質穩(wěn)定、易于制備和保存、腫瘤型別通用性強、治療費用相對較低等優(yōu)勢而成為腫瘤免疫治療的新方法。眾所周知，疫苗療效的關鍵在于其抗原，而有效的抗原遞呈是腫瘤免疫治療中不可缺少的重要環(huán)節(jié)。MAGE-n 基因是我室首次發(fā)現(xiàn)的 MAGE 家族中的新成員[1]，肝癌陽性率達 40%，該基因的表達模式與其他MAGE 基因相同，可作為腫瘤特異性免疫治療的靶分子。后續(xù)研究中，我們應用表位預測結合免疫重建等技術篩選出一條具有特異性免疫活性的HLA-A2 限制性 CTL（cytolytic T lymphoeyte）表位 MAGE-n（159-167）QLVFGIEVV，經免疫學實驗證實，體內外均可有效地誘導特異性 CTL 的產生，有效殺傷腫瘤細胞[2]。文獻[3]和我們以往的工作表明，將 HSP70（heat shock protein，HSP）與腫瘤肽復合物聯(lián)合制成疫苗能夠激發(fā)抗原特異的CTL 反應。本研究選擇 HSP70 為載體，構建MAGE-n 表位肽與 HSP70 的融合基因，并進行表達純化。期望利用 HSP70 的分子伴侶作用加強APC（antigen presenting cell）細胞對抗原的加工遞呈，以增強其免疫原性，為構建新型的腫瘤疫苗提供更有效的抗原奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

菌種E.coliBL21（DE3）、原核表達載體pET-28a（+）、含 HSP70 基因全長片段的質粒pCDNA3.1（+）/HSP70 均由本室保存；質粒小樣快速提取試劑盒和小量 DNA 片段快速膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；Pyrobest DNA 聚合酶、T4 連接酶、限制性內切酶購自日本 TaKaRa 公司；Ni Sepharose 6FF 親和層析填料購自美國 GE 公司。

1.2 方法

1.2.1 采用 PCR 法構建 QLVFGIEVV 與 HSP70的融合基因 根據(jù)引物設計原則以及 HSP70 基因的核苷酸序列，分別設計上游引物 Mn70-1 及下游引物 Mn70-2，在下游引物中加入 QLVFGIEVV的核苷酸序列（共 27 個堿基），并在引物兩端分別加入 Sac I、Hind III 酶切位點，引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。Mn70-1：5’ CCG GAG CTC ATG GCT CGT GCG GTC GGG ATC 3’；Mn70-2：5’ CGG AAG CTT TCA GAC GAC CTC TAT GCC GAA CAC TAA TTG CTT GGC CTC CCG GCC GTC 3’。此序列中方框標記處分別為Sac I、Hind III 酶切位點，劃線部分為表位肽QLVFGIEVV。反應條件為：94℃預變性 5min，94℃變性 1min，57℃退火 1min，72℃延伸150 s，循環(huán) 1 次；94℃變性 1min，67℃退火及延伸 210 s，循環(huán) 30 次，72℃延伸 7min，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收。

1.2.2 重組質粒 pET-28a（+）/QLVFGIEVVHSP70 的構建 用 Sac I、Hind III 雙酶切 PCR擴增的融合基因 QLVFGIEVV-HSP70 和表達載體pET-28a（+）進行瓊脂糖凝膠電泳。分別回收目的片段和表達載體，以 T4 DNA 連接酶于 16℃連接過夜，轉化感受態(tài)E.coliBL21（DE3）。卡那平板篩選陽性克隆。提取陽性克隆菌質粒，以 Sac I和 Hind III 酶切和 DNA 序列分析鑒定陽性克隆。

1.2.3 融合基因 QLVFGIEVV-HSP70 的誘導表達及純化 將含 pET-28a（+）/QLVFGIEVV-HSP70質粒的E.coliBL21（DE3）接種于 2 ml LB/Kan+的培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約 0.6，加入終濃度為1mmol/L 的 IPTG 誘導，不加 IPTG 者為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 取出，離心收菌，加入SDS-PAGE 上樣緩沖液，混勻，煮沸 5min，在離心半徑 8.4cm，12 000 r/min 條件下離心 10min，取上清經 SDS-PAGE 鑒定表達融合蛋白的菌落。

對 SDS-PAGE 鑒定有 QLVFGIEVV-HSP70融合蛋白表達的菌落進行大量（100～150 ml）擴增誘導，在離心半徑 8.4cm，5 000 r/min，4℃條件下離心 5min，將菌體重懸于 10 ml 細菌裂解緩沖液（50mmol/L 磷酸緩沖液，pH 7.5），超聲破碎，18 000×g，4℃離心 10min，取上清過 Ni Sepharose 6FF 親和層析柱，平衡液包含 40mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl，50mmol/L 磷酸緩沖液，pH 7.4；洗脫液包含 300mmol/L 咪唑，0.5 mol/L NaCl，50mmol/L磷酸緩沖液，pH 7.4。用 10%SDS-PAGE 電泳鑒定。

2 結果

2.1 MAGE-n159-167（QLVFGIEVV）表位肽與 HSP70融合基因的構建

以 pCDNA3.1（+）/HSP70 質粒為模板，在下游引物的 5’ 端引入 27 個堿基的模擬表位基因，經 PCR 將 QLVFGIEVV 與 HSP70 的序列進行連接，獲得了 2.0 kb 的融合基因，與預期目的片段大小一致（圖1）。

圖1 QLVFGIEVV-HSP70 融合基因 PCR 結果的瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of QLVFGIEVV-HSP70 fusion gene PCR product

2.2 原核表達載體 pET-28a（+）/QLVFGIEVV-HSP70的鑒定

pET-28a（+）/QLVFGIEVV-HSP70 重組質粒經 Sac I/Hind III 雙酶切后，從 pET-28a（+）載體上消化釋放出唯一的一條約 2.0 kb 的酶切片斷，與目的片斷大小相符（圖2）。其 cDNA 序列測定結果表明：肝癌抗原肽基因序列已連接于 HSP70的 3’ 末端，HSP70 序列與基因庫中的一致。在HSP70 的 5’ 端有起始碼，抗原肽基因序列的 3’端有終止碼，序列分析的結果與設計相符。

圖2 pET-28a（+）/QLVFGIEVV-HSP70 重組質粒的酶切鑒定Figure 2 Identification of recombinantpET-28a(+)/QLVFGIEVV-HSP70

2.3 大腸桿菌的融合蛋白表達及純化

SDS-PAGE 電泳顯示經 IPTG 誘導后，重組載體 PET-28a（+）/QLVFGIEVV-HSP70 在約 71 kD處有一條高效表達的蛋白條帶，與預期大小一致，未經誘導的重組載體未見此現(xiàn)象。經 Ni Sepharose 6FF 親和層析后，在分子量約為71 kD 處有 1 條純化的蛋白帶（圖3）。經 BandScan 軟件分析，目的蛋白純度為93.2%。

圖3 原核表達 QLVFGIEVV-HSP70 融合蛋白 SDSPAGE 電泳分析Figure 3 Analysis of prokaryotic expression QLVFGIEVVHSP70 by SDS-PAGE

3 討論

腫瘤抗原的研究不僅對闡明免疫應答機制的腫瘤免疫逃避機制具有十分重要的理論意義，而且對腫瘤的發(fā)病學、診斷、治療以及疫苗制備都具有重要的應用意義，是當今國際腫瘤免疫學研究的一個熱點，也是一個難點。目前，國內外已經對黑色素瘤、前列腺癌、腦膠質瘤、乳腺癌等多種腫瘤的肽疫苗進行了臨床試驗并取得了一定效果。腫瘤多肽疫苗雖具備諸多的優(yōu)勢但也因存在單獨免疫時免疫原性較弱、體內易降解、只能激發(fā)低水平的CTL 反應等問題而難以獲得理想的抗腫瘤效果。

有實驗證實，MAGE 蛋白及其 CTL 表位不僅能在體外有效誘導特異性細胞毒性 T 淋巴細胞的產生，而且也能在體內誘導特異性 CTLs 的產生，并使部分患者的腫瘤有所縮小或完全消退[4]。目前，已有數(shù)十個 CTL 表位被鑒定，且這些表位均可在體內、外激發(fā)特異性 CTL 抗瘤免疫應答，部分多肽表位已進入臨床 I 期和 II 期實驗，并取得較好的療效。其中本課題組篩選鑒定出的 MAGE-n 第159～167 位（QLVFGIEVV）為HLA-A2 分子遞呈，并可激活 CD8+ 和 CD4+ T 細胞[2]。后續(xù)的工作中我們將 MAGE-n 與 MAGE-3 的 HLA-A2限制性表位聯(lián)合應用進行研究，證實了聯(lián)合表位肽較單個表位肽具有更強的免疫效應[5]。CTL 表位肽疫苗抗腫瘤的機制在于用 CTL 表位肽刺激機體后，可引起抗原特異性的 CTL 細胞的克隆增殖，而 CD8+ 的 CTL 是目前認為抗腫瘤免疫的主要效應細胞[6]，其向胞外釋放穿孔素、細胞溶解素等物質或通過細胞表面的死亡受體等殺滅靶細胞，同時亦可分泌 IFN-γ 等細胞因子間接殺傷腫瘤細胞，為殺傷腫瘤創(chuàng)造一個良好的微環(huán)境。

雖然 MAGE 為腫瘤的免疫治療提供了良好的腫瘤特異性抗原，但是對抗原的有效加工提呈也是腫瘤免疫治療中的一個關鍵問題。HSP70 具有類似 MHC 結合抗原肽的結構域，可作為抗原遞呈分子直接將抗原肽遞呈至細胞表面激發(fā)特異的 γδ T 細胞反應。更為重要的是，HSP 本身無免疫原性，但所結合的多肽具有免疫原性，HSP 不具有多態(tài)性，HSP-肽復合物在同種內的相互作用是可行的[7]。有研究者將 HSP 肽-復合物用于人的腫瘤治療，I 期臨床試驗結果表明沒有明顯的自身免疫效應和細胞毒性，可使 50%患者的 CD8+ T 細胞增加，部分患者還有 NK 細胞擴增趨勢，顯示出了臨床應用前景[3]。我們以往的研究結果也證實HSP70 能夠增強 MAGE3/HSP70 蛋白疫苗的CTL 效應[8]。相比其他免疫佐劑而言，將 HSP70與腫瘤肽復合物聯(lián)合制成疫苗能夠激發(fā)抗原特異的 CTL 反應，具有更廣闊的臨床應用前景。本研究中我們采用 PCR 方法將 MAGE-n159-167（QLVFGIEVV）的 cDNA 序列簡便、快捷地融合到 HSP70 的 3’ 末端，經酶切鑒定及測序證實，融合基因構建成功，抗原肽 QLVFGIEVV 與HSP70 基因的開放讀框正確，并在大腸桿菌中表達出與預期 Mr 大小一致的蛋白，該表達產物為肽疫苗的研制提供了實驗基礎。

[1]Wu W, Sui YF, Ye J, et al.The cloning of tumor-associated gene MAGE in human hepatocellular cell line.Chin J Cell Mol Immunol,2002, 18(3):270-273.(in Chinese)武文, 隋延仿, 葉菁, 等.人肝癌細胞系中腫瘤相關基因MAGE的克隆.細胞與分子免疫學雜志, 2002, 18(3):270-273.

[2]Dong HL, Sui YF, Li ZS, et al.Efficient induction of cytotoxic T lymphocytes specific to hepatocellular carcinoma using HLA-A2-restricted MAGE-n peptide in vitro.Cancer Lett, 2004,211(2):219-215.

[3]Blachere NE, Li Z, Chandawarkar RY, et al.Heat shock protein-peptide complexes, reconstituted in vitro, elicit peptide specific cytotoxic T lymphocyte response and tumor immunity.J Exp Med, 1997, 186(8):1315-1322.

[4]Marchand M, van Baren N, Weynants P, et al.Tumor regressions observed in patients with metastatic melanoma treated with an antigenic peptide encoded by gene MAGE-3 and presented HLA-A1.Int J Cancer, 1999, 80(2):219-230.

[5]Zhang XM, Zhang YF, Huang Y, et al.The anti-tumor immune response induced by a combination of MAGE-3/MAGE-n-derived peptides.Oncol Rep, 2008, 20(1):245-252.

[6]Schmidt-Weber CB, Blaser K.Immunological mechanisms in specific immunotherapy.Springer Semin Immunopathol, 2004, 25(3/4):377-390.

[7]Srivastava PK.Immunotherapy for human cancer using heat shock protein-peptide complexes.Curr Oncol Rep, 2005, 7(2):104-108.

[8]Ma JH, Sui YF, Ye J, et al.Heat shock protein 70/MAGE-3 fusion protein vaccine can enhance cellular and humoral immune responses to MAGE-3 in vivo.Cancer Immunol Immunother, 2005, 54:907-914.