房青，高福云，徐梅，張文健，葉麗亞，許世清，許亞平，李成輝，婁晉寧

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是病毒性肝炎一種危重的臨床綜合征，由于起病急，療效差，患者生存率不足 20%[1]。雖然肝移植是 ALF有效的治療措施，但由于肝供體的嚴重缺乏，大多數(shù)患者在等待供體過程中死亡。生物人工肝支持系統(tǒng)（bioartificial liver support system，BALSS）被認為是未來最有希望在體外提供全面肝功能支持的有效治療方法[2]。

BALSS 的關鍵生物材料是肝細胞。雖然，新鮮分離的豬肝細胞和人的肝細胞瘤細胞都曾經(jīng)被應用作為生物人工肝的細胞材料，但由于這些細胞存在過敏反應、病毒感染和誘發(fā)腫瘤等不安全因素，其臨床治療應用受到很大限制。因此，建立一種永生化人肝細胞系對 BALSS 的建立具有非常重要的意義[3-4]。

我們應用 SV40 Tag 和端粒酶轉染原代人肝細胞，并通過單細胞克隆篩選建立了永生化人肝細胞系（immortalized human hepatocytes，IHH）。前期的研究表明，IHH 表現(xiàn)高增殖活性，可在微載體上高密度培養(yǎng)，體內不具有成瘤性。體外分析表明：IHH 具有正常肝細胞的主要功能特性，表達與肝臟解毒、代謝、合成和生物轉化相關的基因和蛋白。將 IHH 與重癥肝衰竭患者血清孵育后，可使血清膽紅素進行性地降低，血清尿素氮（BUN）濃度進行性升高，表明我們建立的 IHH 具有對膽紅素和血氨的解毒功能[5]。在本研究中，應用微載體培養(yǎng)的 IHH，注射到 ALF 小鼠的腹腔內，進行腹膜透析治療，評價其對 ALF 小鼠的治療作用，以評價IHH 對 ALF 鼠提供肝功能支持的有效性，為利用IHH 構建人源化生物人工肝提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 試劑 cytoporeTM2 微載體購自瑞典 GE Healthcare 公司；活細胞計數(shù)試劑盒 CCK-8 購自日本 Dojindo 公司；小鼠抗人 α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT）抗體購自美國 Sigma 公司。

1.1.2 實驗動物 BALB/c 裸鼠，雄性，SPF 級，6～8 周齡，體重 18～22 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 IHH 細胞的微載體培養(yǎng) 1 g cytoporeTM2微載體用 100 ml PBS（pH 7.4）水化，120℃高壓消毒 20min，PBS 洗 2 次，含 20%胎牛血清的肝細胞培養(yǎng)基浸泡過夜。每毫升微載體接種 105個對數(shù)生長期 IHH，最初 6 h 內每隔 30min 輕柔搖動，細胞貼附微載體后每隔 3 d 更換新鮮肝細胞培養(yǎng)基。微載體上 IHH Giemsa 染色光鏡下觀察并拍照。IHH 接種微載體后每隔 5 d，取 0.1 ml 微載體，加入含 10%CCK-8 的肝細胞培養(yǎng)液，設5 個平行樣，37℃孵育 3 h，上清用酶標儀測定450 nm 吸光度，繪制生長曲線。

1.2.2 裸鼠急性肝衰竭模型的制備 45 只裸鼠腹腔注射 CCl4誘導急性肝衰竭，用橄欖油將 CCl4稀釋成 20%的溶液，分 2 次腹腔注射，劑量分別為15 和 5 μl/g 體重，間隔 24 h。第2 次腹腔注射 CCl4后，所有裸鼠均在 24～48 h 內死亡，肝組織病理發(fā)現(xiàn)明顯肝細胞壞死。

1.2.3 IHH-微載體透析治療 急性肝衰竭模型制備成功后，裸鼠隨機分為3 組，每組 15 只。⑴未治療組：未給予任何治療；⑵空微載體組：在第2 次 CCl4注射后 6 h，給予 2 ml 空微載體腹腔注射；⑶IHH 治療組：在第2 次 CCl4注射后 6 h，給予 2 ml 培養(yǎng) IHH 的微載體（5×106/ml）腹腔注射。各組動物在第2 次注射 CCl4后 24 h，取血檢測谷丙轉氨酶 ALT，取肝臟做病理學和免疫組化分析，各組剩余動物每天記錄生存率，連續(xù) 14 d。

1.2.4 肝臟病理及免疫組化分析 取各組動物肝臟組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī) HE 染色，顯微鏡下觀察，拍照。免疫組化分析時，各組肝組織切片用 3%H2O2封閉，與小鼠抗人 α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT）抗體（稀釋至10 μg/ml）在 37℃孵育 1 h，PBS 洗 3 次后與辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗鼠 IgG 在 37℃孵育 30min，PBS 洗 5 次后加入 DAB 顯色液顯色，顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

用 SPSS16.0 統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料采用±s表示，多組計量資料的比較采用F檢驗，以壽命表法計算累計生存率，生存率的比較采用 Kaplan-Meier 法。P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IHH 的微載體培養(yǎng)

每毫升微載體接種 105個 IHH 后 24 h，幾乎所有 IHH 均貼附于微載體，培養(yǎng)約 21 d 后，90%以上微載體上細胞匯合，IHH 可在大孔微載體表面及孔道內高密度生長（圖1）。

圖1 IHH 在微載體 cytoporeTM 2 上培養(yǎng)（A：Giemsa 染色，放大倍數(shù)：100 倍；B：微載體培養(yǎng) IHH 細胞生長曲線）Figure 1 IHH cultured on microcarrier cytoporeTM 2.A:Giemsa staining of IHH (magnification is×100); B: Growth curve of IHH cultured on microcarriers.

2.2 IHH 微載體治療對 ALF 裸鼠生存率的影響

所有裸鼠在第2 次注射 CCl424 h 后，轉氨酶升高至正常值的 10 倍以上，提示肝細胞明顯受損（表1）。未治療組 12 只裸鼠全部于第2 次注射 CCl424 h 后死亡，空微載體組在第2 次注射CCl424 h 后死亡 11 只，另外 1 只也在第2 天死亡。而 IHH 治療組在第2 次注射 CCl424 h 后死亡 2 只，其余 10 只均存活至實驗結束（14 d），生存率為83.3%，與兩對照組相比有顯著性差異（u= 24.855，P= 0.000，P＜0.01）（圖2）。

表1 CCl4 誘導的 ALF 裸鼠轉氨酶檢測結果（IU/L，±s）Table 1 Aminotransferase levels of ALF mice induced by CCl4 (IU/L,±s )

表1 CCl4 誘導的 ALF 裸鼠轉氨酶檢測結果（IU/L，±s）Table 1 Aminotransferase levels of ALF mice induced by CCl4 (IU/L,±s )

CCl4 制備 ALF 模型后治療時間Treated time of ALF model induced by CCl4組別Groups CCl4 誘導前Before induction by CCl4 1 天 1 day 3 天 3 days 7 天 7 days 14 天 14 days未治療組 Untreated group 84.7±17.51 1302.3±200.17 – – –空微載體組 Empty microcarriers group 84.7±17.51 1481.0±139.69 – – –IHH 治療組 IHH-microcarriers group 84.7±17.51 1226.0±221.51 845±56.35 89.0±19.29 96.0±30.32

圖2 CCl4 誘導裸鼠 ALF 的生存曲線Figure 2 Survival curve of ALF mice induced by CCl4

2.3 肝組織病理學分析

肝臟組織切片 HE 染色結果顯示，CCl4誘導急性肝衰竭后 1 d，與正常裸鼠肝臟（圖3A）相比，未治療組（圖3B）、空微載體組（圖3C）和 IHH治療組（圖3D）均可見廣泛的肝細胞壞死，壞死區(qū)自小葉中央靜脈向四周蔓延，僅在肝小葉周邊區(qū)有少數(shù)殘余肝細胞，肝竇明顯擴張充血。而經(jīng) IHH治療后存活的裸鼠肝臟隨著治療時間的延長，與IHH 組 1 d（圖4B）相比，IHH 治療 7 d（圖4C）可見肝細胞壞死逐漸減少，肝索結構逐漸恢復，淤血減輕，IHH 治療 14 d（圖4D）的裸鼠肝臟組織無明顯肝細胞壞死，正常肝索結構恢復，未見淤血，已類似正常裸鼠肝臟組織（圖4A），IHH 治療組各個時間點的肝組織切片均可見長有 IHH 的微載體填充了肝細胞的壞死缺損（圖4）。

圖3 正常及制備 ALF 模型后 1 d 鼠肝臟組織病理學檢查（A：正常肝臟；B：未治療組；C：空微載體組；D：IHH治療組。HE 染色，放大倍數(shù) 200 倍）Figure 3 HE staining of normal liver and liver affected by ALF for 1 day.A: Normal liver; B: Untreated group; C: Empty microcarriers group; D: IHH-microcarriers group, Magnification×200.

圖4 IHH 治療不同時間 ALF 鼠肝臟組織病理學變化（A：正常組；B：IHH 治療1 天；C：IHH治療 7 天；D：IHH 治療 14 天。HE 染色，放大倍數(shù) 200 倍）Figure 4 HE staining of ALF mice liver treated by IHH.A: Normal liver; B: IHH-microcarriers treated for 1 day; C: IHH-microcarriers treated for 7 days; D: IHH-microcarriers treated for 14 days, Magnification×200.

2.4 微載體上 IHH 免疫組化染色檢查

圖5 顯示肝組織切片中 α1-AT 的免疫組化染色結果，空微載體組蛋白染色為陰性（圖5A）。IHH 治療組微載體上細胞可見棕黃色反應產(chǎn)物（圖5B），而裸鼠肝細胞和背景無染色。所用的抗體為小鼠抗人 α1-抗胰蛋白酶（α1-AT）抗體，與小鼠的相應抗原無交叉反應。

3 討論

肝細胞是生物人工肝支持系統(tǒng)的核心成分。理想的肝細胞是決定生物人工肝成功與否的關鍵。國際消化系統(tǒng)疾病顧問委員會在《暴發(fā)性肝衰竭的控制現(xiàn)狀》生物人工肝專題中將理想的肝細胞描述為：①人源性、正常（非惡性）表型肝細胞；②能夠高活性地準備；③容易快速高密度地培養(yǎng)，且能穩(wěn)定保持良好的分化狀態(tài)；④保持大部分成熟肝細胞的合成、解毒及其他特殊功能[6]。

圖5 ALF 鼠肝免疫組化分析（A：空微載體；B：IHH 微載體）Figure 5 Immunohistochemical staining for α1-AT.A: The empty microcarriers; B: IHH-microcarriers.

正常成人肝細胞由于來源匱乏，體外不增殖，難以成為生物人工肝的理想細胞。我們通過SV40Tag 和端粒酶催化亞單位 HERT 轉染正常成人肝細胞，建立了永生化的人肝細胞系 IHH。生物學特性分析表明，我們建立的 IHH 具備較完備的肝細胞功能，包括表達參與膽紅素代謝的酶UGT1、參與氨代謝的酶 GS、參與生物轉化的酶GST 及合成凝血因子等。進一步，我們應用 IHH在體外與肝衰竭患者的血清共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)血清中的膽紅素隨共培養(yǎng)時間進行性地降低，而血清尿素隨共培養(yǎng)時間進行性地升高，表明這些細胞具有膽紅素代謝解毒和轉氨的功能。

為了評價 IHH 的體內解毒功能，制備一種適宜的 ALF 動物模型是必要的。Terblanche 和Hickman[7]提出理想的 ALF 模型應該具備以下標準：①具有可逆性：動物對適宜的治療有反應并可能存活；②具有可重復性：未經(jīng)治療，動物有較一致的死亡率；③動物死于肝衰竭本身；④具有治療窗口期：由肝衰竭到死亡應有足夠時間可進行治療。采用 CCl4制備小鼠 ALF 模型，當劑量過大時由于伴有神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟損傷，動物死亡迅速，治療窗口期過短；而劑量過小時肝損傷輕微，動物不治療的死亡率低[8]。我們采用間隔 24 h 兩次腹腔注射 CCl4的方法：第1 次給予總劑量的 75%，第2 次給予總劑量的 25%，這樣可使肝損傷的程度在死亡的臨界值，使微載體肝細胞的移植能夠發(fā)揮明顯的作用，并且兩次給藥間提供較充分的治療時間。實驗結果表明此方法具有很好的重復性。

由于肝細胞需要貼附于表面恢復極性才能存活和保持功能狀態(tài)[9]。我們將 IHH 培養(yǎng)于大孔微載體 cytoporeTM2 上。這種微載體表面經(jīng)過特殊處理，細胞貼附牢固不易脫落，其表面積與體積比大，不易發(fā)生接觸抑制，有利于 IHH 細胞的高密度培養(yǎng)；由于微載體的孔道直徑約為30 μm，肝細胞可進入到微載體孔道內生長增殖，有利于避免液體流動時剪切力對細胞的傷害。

將永生化人肝細胞系 IHH 培養(yǎng)于微載體，對ALF 裸鼠進行腹腔透析治療，可使 ALF 裸鼠的轉氨酶降低至正常水平（表1），并且治療后 ALF小鼠的存活率顯著提高，由兩對照組存活率的 0%提高到 83.3%，并持續(xù)至長期存活（圖2）。肝組織病理檢查顯示，CCl4誘導 ALF 后，肝組織可見大量肝細胞壞死，壞死區(qū)波及整個肝小葉，肝索結構被破壞，肝竇淤血（圖3）。經(jīng) IHH 治療后存活的小鼠肝組織隨治療時間延長，肝細胞壞死逐漸減輕，肝索結構逐漸恢復。IHH 治療 14 d 的肝臟組織已類似正常肝臟組織（圖4）。IHH 治療后存活 14 d 的裸鼠肝臟組織的免疫組化染色，可見微載體上細胞染色陽性，而裸鼠肝細胞和背景無染色，表明小鼠抗人 α1-抗胰蛋白酶 （α1-AT）抗體與小鼠的相應抗原無交叉反應，進一步證實微載體上的細胞為人源化肝細胞，即 IHH。結果表明注射入 ALF 鼠腹腔的 IHH 可存活并填補了肝壞死缺損處（圖5）。

目前，國內外許多實驗室都試圖建立永生化人肝細胞系，但這些肝細胞在永生化后大多具有功能缺陷[10]。具有正常人肝細胞主要生物學特性，并具有體內、體外代謝解毒功能的永生化人肝細胞系罕見文獻報道。結果表明，我們所建立的 IHH 具有正常肝細胞的代謝解毒功能，可作為未來制備人源化生物人工肝的細胞材料。

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