職愛民 左建軍 黃志毅 鄒仕庚 馮定遠(yuǎn)

腸粘膜上皮細(xì)胞(Intestinal epithelial cells,IEC)是腸道的重要功能細(xì)胞，參與腸道食糜的消化、吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等，并與腸道的內(nèi)、外分泌功能關(guān)系十分密切。長(zhǎng)期以來(lái)，在研究IEC的生物學(xué)功能、細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控因素，物質(zhì)吸收與代謝等多采用腸道腫瘤細(xì)胞系為試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚1]。然而癌細(xì)胞是非正常的細(xì)胞，其生理特征明顯不同于正常細(xì)胞，單純由癌細(xì)胞系的研究結(jié)果來(lái)解釋正常細(xì)胞的行為，明顯有其不足。原代培養(yǎng)是從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，原代培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特性變化較少，最能反映和接近體內(nèi)生長(zhǎng)特性，是一種良好的試驗(yàn)載體。國(guó)外早在1993年就有豬腸細(xì)胞原代培養(yǎng)的報(bào)道[2]，其它類型的豬組織細(xì)胞原代培養(yǎng)的報(bào)道也不少[3-5]，國(guó)內(nèi)關(guān)于動(dòng)物體細(xì)胞原代培養(yǎng)的報(bào)道多集中在其它動(dòng)物身上[6-9]，而關(guān)于豬IEC原代培養(yǎng)的方法一直屬于空白。本試驗(yàn)的目的就是通過(guò)機(jī)械和酶消化結(jié)合的方法建立豬IEC原代培養(yǎng)的系統(tǒng)，為豬腸道營(yíng)養(yǎng)的研究提供新的試驗(yàn)材料。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

新生杜×長(zhǎng)×大三元雜交仔豬（未吮奶），購(gòu)于廣東省原種豬場(chǎng)。

1.2 主要儀器設(shè)備與試劑

NU-2500型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Nuaire公司，美國(guó))；IX70型倒置生物顯微鏡(Olympus公司，日本)；5804R型高速大容量冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司,德國(guó))；SWCJ-1F型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化，中國(guó))；HVE-50型高壓蒸汽滅菌鍋(HIRAYAMA公司，日本)；GF-M2000型酶標(biāo)儀（山東高密彩虹儀器公司）；CS101-2AB型鼓風(fēng)干燥箱(重慶試驗(yàn)設(shè)備廠)；79-1型磁力加熱攪拌器(江蘇金壇榮華儀器總廠)；Orion420A+型酸度計(jì)(Thermo Electron公司，美國(guó))；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和膠原酶Ⅱ型(Gibico公司)，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（杭州四季青公司），青霉素、鏈霉素、β-甘油磷酸鈉、硝酸鈷、硫化銨(Sigma 公司)，NaCl、KCl、NaH2PO4·12H2O，K2HPO4、丙酮、硝酸鈣、硫酸鎂等試劑均為國(guó)產(chǎn)、分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 豬IEC的分離培養(yǎng)

2.1.1 主要試劑配制

按照說(shuō)明書配制DMEM-F12不完全培養(yǎng)基，0.22 μm過(guò)濾除菌，分裝，4℃避光保存?zhèn)溆谩? gⅡ型膠原酶干粉溶于100 ml上述配好的DMEM-F12不完全培養(yǎng)液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，1.5 ml Eppendorf管以1 ml/管分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。DMEM-F12完全培養(yǎng)基為DMEM-F12不完全培養(yǎng)基加10%的胎牛血清。

2.1.2 豬IEC的分離

參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[10－11]并根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整,具體如下:將剛出生未吮乳的仔豬頸動(dòng)脈放血處死,75%的酒精擦洗消毒后，置于超凈工作臺(tái)。無(wú)菌條件下打開腹腔,整體分離腸道,迅速投入盛有15 ml 37℃預(yù)熱DMEM-F12不完全培養(yǎng)基的平皿中；分別取十二指腸、回腸和空?qǐng)龈?5 cm左右，沿縱向剪開，培養(yǎng)基沖洗三遍并用玻片輕輕刮去表面雜物；清洗后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新的盛有15 ml 37℃預(yù)熱DMEM-F12不完全培養(yǎng)基的平皿中，取出小腸，DMEM-F12培養(yǎng)基分離IEC細(xì)胞，用玻片輕輕分離腸粘膜組織；用移液器吹打均勻后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入Ⅱ型膠原酶至0.1%終濃度；分別置4℃和37℃各消化12 h和2 h后加等量的DMEM-F12完全培養(yǎng)基終止消化，1000 r/min離心10 min后移去上清并用DMEM-F12完全培養(yǎng)基懸浮，重復(fù)一次后完全培養(yǎng)基懸浮并計(jì)數(shù)，按（1～5）×105密度接種，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)。

2.2 豬IEC的傳代培養(yǎng)

移除培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞兩次，然后加入0.25%的胰酶，鏡下觀察大部分細(xì)胞回縮呈橢圓形時(shí)小心移除消化液，加入完全培養(yǎng)液吹打細(xì)胞懸液，使其均勻，調(diào)整所需細(xì)胞密度，接種后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)。

2.3 MTT法測(cè)定豬IEC的增殖

四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)母液(5 mg/ml)：稱取250 mg MTT，溶于50 ml PBS中，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌,分裝后-20℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

參照Sladowski的方法并做改進(jìn)[12]，具體如下：將細(xì)胞懸液稀釋為5×104個(gè)/ml，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔 200 μl。共接 10板。分別于接種后 24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h 取一板細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，在每孔中加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液，入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h，取出棄上清液，用PBS清洗一遍后每孔中加入200 μl DMSO，室溫下放置30 min，用酶標(biāo)儀讀取490 nm處吸光值(OD490)。

2.4 豬IEC的鑒定

2.4.1 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）的鑒定

取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞3次；80%冷丙酮固定10 min，吸棄，PBS洗3次；加入酶反應(yīng)基質(zhì)液 （2%巴比妥鈉1 ml、3%β-甘油磷酸鈉1 ml、2%硝酸鈣 2 ml、2%硫酸鎂 1 ml、蒸餾水 5 ml,pH=9.2～9.4）37℃反應(yīng)2 h,吸棄，PBS洗3次；加入2%硝酸鈣2 min,吸棄，PBS洗3次；加入2%硝酸鈷2 min后吸棄;加入2%硫化銨，放入37℃培養(yǎng)箱10 min，吸棄；流水沖洗，鏡檢。

2.4.2 免疫學(xué)方法鑒定

在96孔板中接種密度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，每孔100 μl，接種4 d后進(jìn)行IEC角蛋白8的免疫酶聯(lián)反應(yīng)，以肌細(xì)胞作為陰性對(duì)照。具體操作步驟如下：80%冷丙酮固定10 min,吸干多余的冷丙酮；用PBS 洗細(xì)胞 2 min×3 次；吸去多余的 PBST,加 50 μl封閉液于孔中,37℃孵育10 min；吸干液體,并用PBST洗2 min×3次；每孔細(xì)胞加 100 μl的一抗（鼠抗人角蛋白 8單抗）,37℃溫育 30 min；PBST洗 2 min×3次;每孔加50 μl抗小鼠生物素二抗,37℃孵育20 min;PBS洗2 min×3次；每孔加50 μl HRP標(biāo)記鏈親和素，37℃孵育 20 min；PBS洗 2 min×3次現(xiàn)用現(xiàn)配 DAB顯色液 （DAB底物緩沖液：DAB顯色液： 底物溶液： 三蒸水=1：1： 1： 20）；每孔加 50 μl DAB 顯色液，室溫顯色2～5 min；自來(lái)水沖洗，鏡檢。

3 結(jié)果

3.1 豬IEC的分離培養(yǎng)

無(wú)菌分離后小腸，可以觀察到懸浮于培養(yǎng)基的絨毛，鏡下清晰可見(圖1a)。消化接種后24～48 h內(nèi)貼壁(圖1b)，貼壁的IEC呈單層生長(zhǎng)，形狀不一，大多呈多角形，細(xì)胞表面有多個(gè)突出，胞漿飽滿，核為圓形或卵圓形，核仁1～2個(gè)，符合小腸上皮細(xì)胞的特征。貼壁的IEC呈單層生長(zhǎng)，形狀呈三角形或者多角形和梭形等，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，5～6 d形成細(xì)胞群落，9～11 d匯合成片(圖1c)，細(xì)胞排列緊密，互相簇?fù)矶纬伞颁伮肥瘶印?圖1d)。

圖1 豬腸上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

3.2 體外原代培養(yǎng)豬IEC的增殖

其生長(zhǎng)曲線如圖2所示。由圖2可知，接種后48 h細(xì)胞處于適應(yīng)休眠期，然后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在216 h后處于停滯期，細(xì)胞不再增殖。群體倍增時(shí)間約為72 h。

圖2 豬IEC的生長(zhǎng)曲線

3.3 豬IEC的鑒定

3.3.1 堿性磷酸酶的鑒定

堿性磷酸酶顯色后，可以看到細(xì)胞胞質(zhì)含黑色顆粒，細(xì)胞骨架清晰；90%以上的細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，如圖3所示。

圖3 堿性磷酸酶鑒定IEC

3.3.2 免疫學(xué)方法鑒定

免疫學(xué)方法鑒定上皮細(xì)胞角蛋白8的表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色，90%以上的細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，如圖4所示。

圖4 免疫學(xué)方法鑒定IEC（100×）

4 討論

位于消化管內(nèi)壁的腸上皮是一種單層組織，由腸隱窩基部的干細(xì)胞不斷增殖。上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間有緊密的聯(lián)系，共同被稱作內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)增殖單位。完整的內(nèi)胚層結(jié)構(gòu)增殖單位可以很好地通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)之間的相互作用或者信息分子的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來(lái)維持自身的平衡[13]。但這個(gè)平衡系統(tǒng)在離體組織樣品中是很脆弱的，因組織突然供血不良、溫度調(diào)節(jié)失衡、細(xì)胞和細(xì)胞、細(xì)胞和ECM的相互作用也會(huì)紊亂。上皮細(xì)胞和ECM聯(lián)系的紊亂會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞程序化的死亡，即失巢凋亡現(xiàn)象(anoikis)[14]。腸干細(xì)胞對(duì)失巢凋亡有高度的敏感性，這也正是腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)很難獲得成功的主要原因。常用的分離方法包括組織切塊移植法、機(jī)械分離法、螯合作用和酶消化法，酶消化法分離上皮細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)可以消除一些細(xì)胞和細(xì)胞之間的相互作用,尤其是上皮細(xì)胞和隱窩成纖維細(xì)胞之間的相互作用。所有酶中膠原酶因其對(duì)上皮細(xì)胞的損傷較小而使用得最多。本研究使用膠原酶分離IEC，效果良好。

細(xì)胞培養(yǎng)成敗的一個(gè)重要因素就是防止污染，從試驗(yàn)材料到試驗(yàn)場(chǎng)地、用具、操作和培養(yǎng)保持，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的不注意，都可能造成試驗(yàn)的失敗。本試驗(yàn)選取新生的、未進(jìn)食的仔豬，其腸腔內(nèi)屬于相對(duì)無(wú)菌環(huán)境，避免了主要的污染來(lái)源。適時(shí)傳代對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)具有重要意義。要注意觀測(cè)細(xì)胞的狀態(tài)，觀察是否有調(diào)亡的現(xiàn)象發(fā)生，正常細(xì)胞鋪滿80%就可以考慮傳代。傳代過(guò)晚會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至引起凋亡。消化時(shí)注意消化時(shí)間和消化液用量的控制，消化液以剛好覆蓋瓶（孔）底為宜，鏡下觀測(cè)控制消化時(shí)間，最佳終止時(shí)間在60%～80%細(xì)胞收縮成圓形時(shí)。在消化細(xì)胞前將胰酶在37℃水浴中溫?zé)?0 min左右，可以達(dá)到最好的消化效果，而且節(jié)省操作時(shí)間，消化后細(xì)胞很容易吹打成為單個(gè)細(xì)胞，因?yàn)槿菀状荡?，所以?duì)細(xì)胞的損傷小。

AKP是一種磷酸單酯鍵水解酶，在堿性條件下活性最強(qiáng)，可以水解磷酸化的糖、核酸和蛋白上的磷酸基團(tuán)。小腸堿性磷酸酶是小腸分化與成熟的一類標(biāo)志性酶，參與小腸的物質(zhì)代謝，因此可作為IEC鑒定的標(biāo)志[15]。本試驗(yàn)中，堿性磷酸酶鑒定呈陽(yáng)性，從生化的角度證明所獲得的細(xì)胞是IEC。細(xì)胞角蛋白為上皮組織的特征性抗原成分[16]，本試驗(yàn)選用生物素標(biāo)記的細(xì)胞角蛋白抗體通過(guò)免疫學(xué)試驗(yàn)來(lái)鑒定豬IEC。試驗(yàn)結(jié)果顯示小腸上皮細(xì)胞為陽(yáng)性(棕色)，陰性對(duì)照不顯色，從細(xì)胞生物學(xué)角度鑒定了所培養(yǎng)的細(xì)胞為IEC。綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)機(jī)械分離和膠原酶消化相結(jié)合的方法，成功地在體外培養(yǎng)了新生仔豬IEC，為豬腸道營(yíng)養(yǎng)建立了理想的試驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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