杜武英,黃 江,胡旭初,余新柄,徐 勁 ,廖興江,戴佳琳

豬帶絳蟲為世界性分布,成蟲寄生于人體腸道引起豬帶絳蟲病,幼蟲寄生于人體皮下、肌肉或內(nèi)臟引起囊尾蚴病〔1〕。在我國(guó),豬帶絳蟲病與囊蟲病分布及流行態(tài)勢(shì)多呈片狀分布,且青壯年發(fā)病率較高,少數(shù)地方近年來兒童囊蟲病有上升趨勢(shì)。本課題組近年來從豬帶絳蟲基因組及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究入手,系統(tǒng)地開展豬帶絳蟲基因的鑒定和功能研究。我們從豬帶絳蟲成蟲全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)中克隆了一個(gè)乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)的同源基因,力圖通過對(duì)該基因及其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和特征進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析,以指導(dǎo)該基因的克隆表達(dá)、重組蛋白的純化及免疫學(xué)特性的初步研究,從而為其生物學(xué)功能研究及其在診斷、藥物及疫苗方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬帶絳蟲成蟲蟲體標(biāo)本 采自四川甘孜州雅江縣,豬帶絳蟲成蟲全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)由北京華大基因研究中心構(gòu)建,大規(guī)模測(cè)序得到多個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag,EST)、利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站的基本局部比對(duì)搜索工具(basic local aligment search tool,Blastx,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)歸并EST獲得Unique Gene(Unigene)由本課題組與上海英駿生物公司合作完成。編碼豬帶絳蟲成蟲LDH基因文庫(kù)質(zhì)粒編號(hào)為0_001458。

1.1.2 質(zhì)粒,菌株 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)和大腸桿菌BL-21/DE3由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 感染豬帶絳蟲豬血清 由貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室提供,病人血清采自豬帶絳蟲流行區(qū)。

1.1.4 主要試劑和工具酶 NcoⅠ,XhoⅠ,T4 DNA連接酶,DNA標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)均購(gòu)自自TaKa-Ra公司;Ex Taq酶(含 dNTP)和異丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG),購(gòu)自美國(guó)Promega公司;Ni-IDA Agarose(cat No:69670)購(gòu)自美國(guó)Novagen公司;蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自立陶宛MBI公司;DNA凝膠回收試劑盒,質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的數(shù)種二抗和DAB(3,3二氨基聯(lián)苯胺)顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德有限公司;PVDF膜購(gòu)自Millipore公司;TMB顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司;SDS等試劑均購(gòu)自上海申友生物科技公司。

1.1.5 引物合成和DNA測(cè)序 基因擴(kuò)增引物和重組質(zhì)粒DNA測(cè)序由Introvigen上海生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Ts LDH-A基因的識(shí)別及其推導(dǎo)氨基酸序列的生物信息學(xué)分析 通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站的基本局部比對(duì)搜索工具(basic local aligment search tool,BlastX,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)程序,將文庫(kù)質(zhì)粒編號(hào)為0_001458的插入序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)分析;利用Vector NTI suite軟件包推導(dǎo)基因的開放閱讀框和氨基酸序列;利用通過瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)(Expert Protein Analysis System,ExPASy,http://ca.expasy.org/)、IEDB Analysis Recource(http://tools.immuneepitope.org/main/jsp/menu.Jsp)提供的分析工具分別預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)等,以及利用 3D-PSSM對(duì)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象建模。

1.2.2 Ts LDH-A基因的的克隆表達(dá) Ts LDHA基因的擴(kuò)增:根據(jù)已獲得的Ts LDH-A編碼序列,利用DNAClub和PCRdesign設(shè)計(jì)引物:

以豬帶絳蟲成蟲cDNA文庫(kù)中Ts LDH-A基因的克隆質(zhì)粒為模板,通過 PCR擴(kuò)增,回收擴(kuò)增產(chǎn)物。

重組原核表達(dá)質(zhì)粒(pET-28a(+)-Ts LDH-A)的構(gòu)建及鑒定:將PCR產(chǎn)物和原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)經(jīng) Nco I和Xho I雙酶切后回收、連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL-21/DE3感受態(tài)細(xì)胞,卡那霉素篩選陽性克隆。對(duì)陽性克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定。

Ts LDH-A基因在大腸桿菌BL-21/DE3中以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,離心收集菌體,制備成電泳樣品并進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

Ts LDH-A基因在大腸桿菌BL-21/DE3中的大量誘導(dǎo)表達(dá)和純化:對(duì)陽性克隆進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),離心收集菌體、超聲裂解后離心收集上清并過濾,參照Ni-IDA Agarose說明書進(jìn)行蛋白純化,收集蛋白洗脫液,SDS-PAGE電泳分析目的蛋白。將洗脫的目的蛋白在0.15mol/L的PBS(pH7.9)透析液中4℃透析24h。透析后的蛋白-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn) 用純化的重組蛋白以腹部皮下多點(diǎn)注射方式免疫SD大鼠,共免疫3次,于末次免疫后2周剪尾采血,分離血清。

1.2.4 Western Blotting檢測(cè)重組蛋白的免疫學(xué)特性 將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE(12%)電泳,使用電轉(zhuǎn)移儀于100V冰浴轉(zhuǎn)印1h,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。一抗分別為重組蛋白免疫的SD大鼠血清、感染豬帶絳蟲的豬血清、感染豬帶絳蟲病人血清、亞洲帶絳蟲病人血清和感染牛帶絳蟲病人血清(1∶100稀釋),二抗相應(yīng)為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗大鼠IgG、山羊抗豬IgG和兔抗人IgG(1∶2 000稀釋)。DAB顯色至出現(xiàn)目的條帶,超純水終止反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 Ts LDH-A的生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 編號(hào)為0_001458文庫(kù)質(zhì)粒的插入序列的Blastx分析 從BLASTX的分析結(jié)果來看,該基因是乳酸脫氫酶A的同源基因,與GenBank中其他物種同源基因的氨基酸序列的一致性為54%左右。從比對(duì)結(jié)果來看,該克隆基因的5′端序列長(zhǎng)于其他物種完整的乳酸脫氫酶編碼序列,該基因應(yīng)該是豬帶絳蟲A型乳酸脫氫酶的全長(zhǎng)基因序列,其最大的ORF就是其完整的編碼區(qū)。Rpsblast分析發(fā)現(xiàn)其有乳酸脫氫酶的保守結(jié)構(gòu)域。

2.1.2 Ts LDH-A蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、翻譯后的修飾位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位ExPASy中ProtParam預(yù)測(cè)Ts LDH-A的理論分子量和等電點(diǎn)分別是35 461.1 Da和7.09。含有9個(gè)半胱氨酸,彼此之間形成二硫鍵可能性小。在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為25.56,低于域值40,蛋白性質(zhì)較穩(wěn)定;脂肪族指數(shù)105.05,總親水性0.239。PROSCAN分析特定位點(diǎn)結(jié)果顯示:Ts LDHA含有5個(gè)潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn);有3個(gè)潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點(diǎn),有1個(gè)酪氨酸激酶(PTK)磷酸化位點(diǎn);7個(gè)潛在的N-肉豆蔻酰位點(diǎn);有1個(gè)L-乳酸脫氫酶活性位點(diǎn),位于189-195位氨基酸。TargetP預(yù)測(cè) Ts LDH-A無信號(hào)肽序列,無線粒體、過氧化酶體、溶酶體和細(xì)胞核等定位序列。

2.1.3 Ts LDH-A一級(jí)結(jié)構(gòu)中包含的結(jié)構(gòu)和功能域特征序列 ExPASy中InterPro Scan掃描結(jié)果顯示該氨基酸序列中含有2段乳酸脫氫酶保守功能域,分別位于N端和C端;在189aa-195aa具有酶的活性位點(diǎn)。

2.1.4 Ts LDH-A的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu) Ex-PASy中PredictProtein分析蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu),該蛋白有三個(gè)跨膜區(qū)(圖1),蛋白所含的9個(gè)半胱氨酸之間都未形成二硫鍵。Sec預(yù)測(cè)α螺旋(H)、β折疊(E)和無規(guī)卷曲(L)的比例分別是36.25∶22.05∶41.69。

圖1 Ts LDH-A的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The topology,secondary structure of Ts LDH-A by Predictprotein

2.1.5 Ts LDH-A的抗原表位分析 IEDB Analysis Resource中B Cell Epitope Prediction Tools分析預(yù)測(cè)Ts LDH-A的B細(xì)胞抗原表位結(jié)果顯示,該氨基酸序列中有4個(gè)主要的表位:13aa-20aa(GSRHGHEP),190aa-199aa(GEHGDSSVPV),215aa-228aa(PKIGQAGDPDDFAS),307-314aa(FSPSEKQS)。

2.1.6 Ts LDH-A的三維結(jié)構(gòu)及線性表位和活性位點(diǎn)的位置 ExPASy中3D-pssm(Phyre Version 0.2)將Ts LDH-A與蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行匹配,通過二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)和折疊,模建Ts LDH-A的三維結(jié)構(gòu)圖。圖中4個(gè)黃色區(qū)段代表B Cell Epitope Prediction Tools預(yù)測(cè)的4個(gè)主要B細(xì)胞抗原表位,其中表位 190aa-199aa(GEHGDSSVPV)中包括LDH活性位點(diǎn)組氨酸(His192,H)。結(jié)合其它同源基因的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究〔2-4〕,將另兩個(gè)LDH活性中心氨基酸精氨酸(Arg105,R)和天冬氨酸(Asp165,D)也標(biāo)注其上。3個(gè)關(guān)鍵氨基酸在二級(jí)結(jié)構(gòu)上相距甚遠(yuǎn),但在空間結(jié)構(gòu)中相互靠近,構(gòu)成酶的活性中心(圖2)。

圖2 Ts LDH-A的3D結(jié)構(gòu)、潛在抗原表位和關(guān)鍵氨基酸的空間位置Fig.2 The 3D structure of Ts LDH-A and the spacial localization of four possible epitopes and key aminoacids

2.2 Ts LDH-A基因的的克隆表達(dá)

2.2.1 原核重組質(zhì)粒的鑒定 將重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定,產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。圖3中第2泳道是PCR產(chǎn)物,第3泳道是雙酶切鑒定結(jié)果,在1000bp左右有一清晰的條帶,與目的基因的大小基本相符,證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 pET28a(+)-Ts LDH-A重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定(1.0%瓊脂糖凝膠電泳)Fig.3 Identification of pET28 a(+)-Ts LDH-A by with enzymes digestion

2.2.2 蛋白表達(dá)純化結(jié)果 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL-21/DE3中表達(dá),SDS-PAGE電泳分析結(jié)果如圖 4中第 4、5、6泳道所示,大約在36kD左右處出現(xiàn)表達(dá)條帶,與目的蛋白分子量基本相符,說明蛋白既有可溶性表達(dá),也有包涵體表達(dá)。純化后蛋白位于圖中第7泳道,其位置與目的蛋白相符,證明目的蛋白純化成功。測(cè)得純化產(chǎn)物的蛋白濃度為0.7mg/mL。

圖4 pET28a(+)-TsLDH-A原核表達(dá)及純化產(chǎn)物的12%SDS-PAGE分析Fig.4 12%SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression and purification products of pET28a(+)-TsLDH-A

2.2.3 Western Blotting鑒定 Ts LDH-A重組蛋白 將純化好的重組蛋白分別與重組蛋白免疫的SD大鼠的抗血清、感染豬帶絳蟲的病人血清及感染豬帶絳蟲的豬血清相互作用后,結(jié)果如圖5所示,在36kDa左右均可見一明顯的免疫反應(yīng)條帶(1、3、5泳道),大小與重組蛋白預(yù)測(cè)的分子量相近,而陰性對(duì)照血清在相應(yīng)的位置均未識(shí)別出該條帶。

3 討 論

多數(shù)體內(nèi)寄生蟲的能量主要源于無氧糖酵解,而乳酸脫氫酶(LDH)是糖酵解途徑的末端酶,在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的輔助下,催化丙酮酸還原為乳酸及乳酸氧化為丙酮酸的可逆反應(yīng),被認(rèn)為是影響寄生蟲能量代謝重要的酶類之一〔5〕。

LDH是一同功酶家族,動(dòng)物和人的LDH是以4個(gè)亞單位組成的四聚體寡聚酶的形式發(fā)揮作用的,其中由A、B兩個(gè)亞基組成的同功酶具有明顯的種屬特異性和組織特異性并與其生化表現(xiàn)型和生理功能相適應(yīng)〔6-9〕,近年的研究還表明LDH的表達(dá)還可能與細(xì)胞周期等有關(guān)〔10-12〕。因此對(duì)LDH同工酶基因的研究不僅可以區(qū)別物種間的遺傳差別和進(jìn)化特征,而且可為動(dòng)物或寄生蟲個(gè)體發(fā)育過程中基因表達(dá)和調(diào)控研究提供良好的模式。既往對(duì)于蠕蟲LDH的研究較少。血吸蟲和華支睪吸蟲 LDH分子結(jié)構(gòu)與功能的研究提示LDH既是一個(gè)有潛力的診斷和疫苗候選抗原,又是吡喹酮、蒿甲醚等重要的抗寄生蟲藥物作用靶點(diǎn)之一,也是研究生物種系進(jìn)化較好的指標(biāo)分子〔2-3,13-16〕。本課題組近年來對(duì)亞洲帶絳蟲成蟲LDH基因的研究結(jié)果也提示,Ta LDH基因是一有潛力的疫苗候選抗原或藥物作用靶標(biāo)〔4,17〕。以上相關(guān)理論及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,研究比較三種人體帶絳蟲(豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲)的乳酸脫氫酶及其同工酶家族成員的結(jié)構(gòu)與功能具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

圖5 pET28a(+)-TsLDH-A重組蛋白的 Western blotting分析Fig.5 Westen blotting analysis of the pET28a(+)-TsLDHA recombinant

本研究首先從課題組構(gòu)建的豬帶絳蟲成蟲cDNA文庫(kù)中篩選出編號(hào)為0_001458文庫(kù)質(zhì)粒,經(jīng)NCBI網(wǎng)站Blastx在線分析,該質(zhì)粒的插入序列編碼的氨基酸序列與GenBank中其它物種的A型乳酸脫氫酶同源性可達(dá)到54%左右,并具有完整的乳酸脫氫酶保守功能域,推測(cè)該質(zhì)粒插入序列為豬帶絳蟲乳酸脫氫酶A的編碼序列,該序列含有完整的開放閱讀框,是一個(gè)全長(zhǎng)cDNA序列。預(yù)測(cè)其編碼的蛋白相對(duì)分子量理論值是35 461.1Da,理論等電點(diǎn)為7.09,蛋白的理化性質(zhì)較穩(wěn)定。

其次,根據(jù)以上分析的理論結(jié)果,本研究應(yīng)用原核表達(dá)載體 pET28a(+)對(duì) Ts LDH-A進(jìn)行亞克隆,轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。PCR、雙酶切及DNA測(cè)序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒pET28a(+)-T s LDH-A構(gòu)建成功。將融合表達(dá)和純化的產(chǎn)物行SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果顯示目的條帶分子量與預(yù)測(cè)值基本一致,表明重組蛋白得到了表達(dá)并且純化成功。Western Blotting結(jié)果表明純化蛋白能被重組蛋白免疫的SD大鼠血清、感染豬帶絳蟲的病人血清和豬血清識(shí)別,說明重組蛋白在純化后具有較好的免疫原性和免疫反應(yīng)性,提示Ts LDHA可能是一潛在診斷抗原。

再次,生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)還提示Ts LDH-A有3個(gè)跨膜區(qū),沒有線粒體、過氧化酶體、溶酶體和細(xì)胞核等亞細(xì)胞定位序列。結(jié)合LDH在其它絳蟲的組織定位和特性,如韓國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)曼氏迭宮絳蟲(Spirometra mansoni,Sm)LDH在成蟲及裂頭蚴的皮層及皮下肌層活性最高〔18〕、本課題組的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示亞洲帶絳蟲LDH重組蛋白定位于成蟲的表膜和蟲卵的胚膜〔17〕,我們推測(cè) Ts LDHA可能在豬帶絳蟲成蟲的表膜上分布較多,而分布在表膜的蛋白則有可能為藥物的靶分子,或是診斷抗原的候選分子。拓?fù)鋵W(xué)分析發(fā)現(xiàn)酶催化中心的組氨酸殘基(His192)位于潛在的 B細(xì)胞抗原表位序列190aa-199aa(GEHGDSSVPV)中,由于 His192是酶活性中心的關(guān)鍵氨基酸,特異性抗體如與之結(jié)合,His192就不能正常行使其在酶促反應(yīng)中的功能,從而會(huì)影響整個(gè)酶的活性,在宏觀上可表現(xiàn)為酶促反應(yīng)受到抑制。由此又可以推斷Ts LDHA特異性抗體可能結(jié)合蟲體表膜上 LDH的抗原表位,這種結(jié)合可能會(huì)抑制酶的活性、影響到蟲體的糖代謝,因而從這一角度分析 Ts LDH-A也可能是一個(gè)重要的藥物靶標(biāo)。同時(shí),Ts LDHA分子暴露在蟲體表膜上使它可能成為免疫攻擊的靶點(diǎn),介導(dǎo)補(bǔ)體的殺傷作用、抗體的ADCC作用和細(xì)胞免疫攻擊,因此Ts LDH-A還可能是一個(gè)疫苗侯選分子。

比較已有的寄生蟲 LDH的研究進(jìn)展,綜合本研究的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)理論、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及合理的分析推測(cè)可知,對(duì)豬帶絳蟲A型乳酸脫氫酶基因的克隆、表達(dá)及可溶性重組蛋白的純化,能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能以及在診斷、疫苗研究方面的作用奠定基礎(chǔ),可以為區(qū)別物種間的遺傳差別和進(jìn)化特征提供線索,甚至有可能在三種人體帶絳蟲個(gè)體發(fā)育過程中基因表達(dá)、調(diào)控的研究和分類關(guān)系方面給我們一定的啟示。

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