鄭惠能,李 莉,陳娟娟,黃仕杰,馬桂林,溫慧欣,沈理通,周常義,黃建煒

1972年Kapikian報道發(fā)現(xiàn)諾如病毒以來,越來越多的研究證實諾如病毒是急性胃腸炎暴發(fā)疫情最主要的病原,也是成人、兒童非菌性腹瀉主要的病原體。由于缺乏簡易、經濟的檢測手段,臨床上尚難與其它病毒性腹瀉相鑒別,其所造成的疾病負擔并未引起人們足夠重視。為了解廈門地區(qū)諾如病毒的流行狀況,以便進一步探索本地區(qū)諾如病毒流行規(guī)律和流行因素,為制訂防控對策提供依據,本研究于2007年4月至2008年7月在3家哨點醫(yī)院開展監(jiān)測,收集了323例病毒性腹瀉患者糞便標本,采用ELISA和realtime RT-PCR法檢測標本中諾如病毒抗原和核酸,分析該人群諾如病毒感染狀況及特征?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 以廈門島內的廈門市第一醫(yī)院和廈門市婦幼保健院以及島外的廈門市第三醫(yī)院為監(jiān)測哨點醫(yī)院,按監(jiān)測方案要求采集病毒性腹瀉病例糞便標本。2007年4月至2008年7月共收集門診和住院病毒性腹瀉患者323例,采集糞便標本10～15g/份,-70℃凍存。病毒性腹瀉病例定義為大便次數(shù)≥3次/d,呈水樣、蛋花樣或稀糊樣便,常規(guī)鏡檢WBC＜15,RBC=0,排除常見細菌、寄生蟲等感染的腹瀉病例。

糞便標本諾如病毒抗原的ELISA檢測。應用德國必發(fā)公司(R-Biopharm Rhone Ltd)第二代和第三代諾如病毒ELISA(RIDASCREEN Norovirus)試劑盒對糞便標本進行諾如病毒抗原檢測。此試劑采用單克隆抗體夾心法,特異性檢測GGⅠ和GGⅡ組諾如病毒的共同抗原。凍存的糞便標本溶解后,以試劑盒中的標本稀釋液10倍稀釋,振蕩混勻、靜置10 min后,室溫5 000r/min離心5 min,取100μL上清液,按照試劑盒說明書檢測和判斷結果。

1.2 病毒RNA提取、檢測與分型 糞便標本溶解后以生理鹽水10倍稀釋、振蕩混勻,10 000r/min離心 5min;取 140μL 上清液,按照 QIAamp Viral RNA Mini KIT的說明書要求以柱離心法提取總RNA,洗脫液為60μL。取 5μL RNA 提取液以深圳太太基因工程公司的諾沃克病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測病毒RNA。陽性標本重提RNA后以上海之江諾如病毒熒光PCR(rRT-PCR)分型試劑盒(GGⅠ+Ⅱ)檢測。核酸擴增使用ABI7500和Biometra PCR儀。

1.3 病毒型別的驗證 隨機取5份GGⅡ組諾如病毒RNA陽性的標本RNA提取液5μL,以QLAGEN OneStep RT-PCR KIT逆轉錄擴增病毒RdPd基因片段,引物序列為NVRPf 5'-ATACCACTATGATGCAGATTA-3'和NVRPr5'-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3',RT-PCR產物2%瓊脂糖膠電泳,回收327bp條帶的擴增產物,以QIAquick Gel Extraction Kit純化后送上海生物工程技術服務有限公司測序。獲得的序列與Gen-Bank數(shù)據庫比對,驗證病毒的型別檢測結果。

2 結 果

2.1 腹瀉病例糞便標本的檢測結果 323例門診、住院的病毒性腹瀉患者糞便標本,ELISA檢測諾如病毒抗原陽性68例,陽性率為21.05%,其中,2007年9月20日以前,使用德國必發(fā)公司第二代諾如病毒ELISA試劑盒檢測159例,陽性20例,陽性率12.58%;2007年9月20日以后,使用該廠家的第三代ELISA試劑盒檢測164例,陽性48例,陽性率29.27%。323例患者糞便標本RT-PCR檢測諾如病毒RNA陽性107例,陽性率為33.13%;抗原和RNA雙陽性52例,抗原或RNA任一項陽性共123例,諾如病毒檢出率為38.08%(123/323)。見表1。

2.2 諾如病毒感染病例分布特征 城市居民病毒性腹瀉患者諾如病毒檢出率為37.12%,農村患者檢出率為40.43%,兩者無顯著性差異(χ2=0.31,P=0.5787);男性患者諾如病毒檢出率為34.41%,女性患者檢出率為38.59%,兩者無顯著性差異(χ2=0.05,P=0.8295);廈門島內居民與島外居民病毒性腹瀉患者的諾如病毒檢出率分別為32.63%和45.86%,島外患者檢出率高于島內患者(χ2=5.79,P=0.0161);門診與住院病例諾如病毒檢出率分別為42.68%和25.30%,門診病例檢出率明顯高于住院病例(χ2=7.71,P=0.0055)。

全年都有感染病例,以1、2月份諾如病毒檢出率最高,分別為66.67%和70%。諾如病毒感染患者年齡最小為21日齡,最大為83歲。1歲以下嬰兒腹瀉病例諾如病毒檢出率達27.50%;20歲至60歲組成人患者檢出率為40%～50%。各年齡組的病毒性胃腸炎患者諾如病毒檢出情況見表2。

2.3 病毒型別與驗證 PCR陽性標本的型別組成:諾如病毒 GGⅡ80份(74.77%)、GGⅠ2份(1.87%)、未定型25份(23.36%)。

隨機選取的5份NoV RNA陽性標本測序獲得的序列完全相同,其中329bp堿基見下圖,與Gen-Bank數(shù)據庫比對,屬于GGⅡ。如,糞便標本251的病毒核酸片段序列與GenBank Norovirus Hu/Duan/Beijing/2006/China比較,片段序列相似度99%(325/328),同屬GGⅡ。

圖1 糞便標本251諾如病毒基因與Norovirus Hu/Duan/Beijing/2006/China的片段序列比較Fig.1 Fecal samples RNA sequence comparisonsbetween 251 Norovirusgeneand NorovirusHu/Duan/Beijing/2006/China

3 討 論

諾如病毒在世界各地都有廣泛的傳播。早年應用電鏡和免疫電鏡檢測諾如病毒,但電鏡檢測方法靈敏度低,且受操作者影響較大,因此檢出率較低。1992年后發(fā)展并使用RT-PCR方法檢測諾如病毒,Frankhauser等在美國33個州1996年1月至1997年6月發(fā)生的90起非菌性急性胃腸炎暴發(fā)中發(fā)現(xiàn)96%的病原為諾如病毒〔1〕,荷蘭、英國、日本和澳大利亞的研究也證實了諾如病毒是引起急性胃腸炎暴發(fā)的最主要病原〔2-3〕。方肇寅等對我國長春、北京、福州等13個地區(qū)1999-2005年5歲以下腹瀉患兒輪狀病毒陰性的糞便標本用ELISA和RT-PCR方法檢測人類杯狀病毒(HuCV),結果顯示,HuCV陽性率 19%(8.3%～38.6%),其中諾如病毒占96.7%,絕大多數(shù)毒株為GG Ⅱ(92.47%)〔3〕。高志勇等報道北京地區(qū)病毒性胃腸炎患者諾如病毒檢出率為 38.89%,97.14%為 GG Ⅱ〔4〕。

表1 各月份NoV病毒檢測結果Table 1 NoV test results of different months in 2007 and 2008

表2 各年齡組NoV檢測結果Table 2 NoV test results of different age subgroup

本研究顯示,廈門地區(qū)病毒性腹瀉患者諾如病毒檢出率為 38.08%,流行優(yōu)勢株為 GGⅡ(74.77%),與國內研究結果基本相符。各年齡組均可感染諾如病毒,但以20-60歲組患者感染率最高,達40%～50%;全年均可檢出諾如病毒感染,以冬春季的1、2月份為高峰,檢出率分別達66.67%和70%,提示本地區(qū)1-2月可能為諾如病毒流行高峰。門診與住院病例諾如病毒檢出率分別為42.68%和25.30%,估計是由于諾如病毒性腹瀉癥狀比輪狀病毒性腹瀉輕,住院患者一般癥狀較重,輪狀病毒檢出率高,諾如病毒檢出率低,在門診患者中情況則相反。40例1歲以下病毒性腹瀉患兒(住院36例、門診4例),諾如病毒的檢出率達27.50%,住院患兒檢出率為27.78%(10/36),雖然未進一步排除輪狀病毒、札如病毒、腸道腺病毒等其他腸道病毒感染所致,但提示諾如病毒乃為本地區(qū)嬰兒腹瀉的重要病原,在嬰幼兒冬春季腹瀉臨床診斷和治療中,除輪狀病毒外還應關注諾如病毒感染。

本研究還顯示,廈門城市與農村地區(qū)的病毒性腹瀉患者諾如病毒感染無顯著性差異,可能與幾年來廈門地區(qū)的城市化建設和社會經濟的快速發(fā)展縮小了城鄉(xiāng)居民在生活水平與享有衛(wèi)生服務之間的差距有關。而廈門島內的病毒性腹瀉患者諾如病毒感染率比島外的低的研究結果,則可能與廈門島內居民的文化程度、經濟條件、個人衛(wèi)生習慣以及島內良好的衛(wèi)生環(huán)境、城市基礎設施建設、衛(wèi)生城市管理等有密切關聯(lián),對其影響因素有待進一步研究,它將有助于科學制定防控策略和更有針對性的防控措施。

〔1〕Fankhauser RL,Noel JS,Monroe SS,et al.Molecular epidemiology of“Norwalk like viruses” in outbreaks of gastroeneuritis in the United States〔J〕.J Journal of Infect Disease,1998,178:1571-1578.

〔2〕Reuter G,Farkas T,Berke T ,et al.Molecular epidemiology of human calicivirus gastroenteritis outbreaks in Hungary,1998 to 2000〔J〕.J Med Virol,2002,68(3):390-398.

〔3〕方肇寅,謝華萍,呂紅霞,等,1999-2005年我國嬰幼兒人杯狀病毒腹瀉研究〔J〕,病毒學報,2007,23(1):9-15.

〔4〕高志勇,呂虹,黃芳,等,90例病毒性胃腸炎患者糞便中諾如病毒檢出情況分析〔J〕,中國病原生物學雜志,2008,3(8):564-567.