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        魚腥草提取液在雞胚內(nèi)抗新城疫病毒試驗(yàn)

        2010-06-07 02:24:22張瑞莉華育平
        中獸醫(yī)學(xué)雜志 2010年3期
        關(guān)鍵詞:雞胚魚腥草血凝

        張瑞莉,劉 娣,梁 堯,張 婧,華育平

        (1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站/東北林業(yè)大學(xué)博士后流動(dòng)站 黑龍江 哈爾濱150086;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院黑龍江哈爾濱 150030)

        新城疫(Newcastle disease,ND),又稱為亞洲雞瘟,是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種高度接觸性傳染病,本病自1926年首次發(fā)生以來,已成為流行廣、死亡率高、經(jīng)濟(jì)損失重大、危害最嚴(yán)重的禽病之一。盡管對(duì)該病在診斷與防制方面進(jìn)行了大量的研究,并取得了較大的成就,但目前其仍是危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展最嚴(yán)重的疫病之一,尚無有效的治療方法[1-5]。因此,研制高效、低毒、無殘留的抗NDV藥物是防治本病的一個(gè)重要措施。

        中藥作為天然產(chǎn)物,不但具有抑菌、殺菌和抗病毒作用,而且能夠調(diào)節(jié)、促進(jìn)機(jī)體的免疫功能,同時(shí)殘毒較低或無殘毒,副作用小,不易產(chǎn)生耐藥性,應(yīng)用于防治畜禽傳染病,前景極為廣闊。魚腥草是一種應(yīng)用廣泛的中藥,其揮發(fā)性成分對(duì)多種病毒都有抑制作用[6]。本試驗(yàn)對(duì)魚腥草在雞胚內(nèi)的抗新城疫病毒活性進(jìn)行試驗(yàn)研究,為臨床進(jìn)一步研究開發(fā)防治新城疫中藥提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        1.1.1 雞胚

        10日齡雞胚,購自哈爾濱市紅星孵化場。

        1.1.2 病毒 雞新城疫病毒(Mukteswar1系),由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供,經(jīng)SPF雞胚增殖,血凝效價(jià)28。

        1.1.3 魚腥草(Houttuynia cordate Thunb.)購于哈爾濱藥材市場。

        1.2 方法

        1.2.1 NDV對(duì)雞胚半數(shù)感染量(EID50)測定

        將病毒液依次作10倍稀釋,接種于10日齡雞胚尿囊腔內(nèi),每個(gè)稀釋度接種0.2ml/枚,作四個(gè)重復(fù),同時(shí)設(shè)正常雞胚對(duì)照。置37℃恒溫箱內(nèi)孵化48h,棄去24h內(nèi)死亡胚,收獲24h后死亡胚及48h活胚的尿囊液,進(jìn)行HA價(jià)的測定[7]。

        1.2.2 魚腥草提取液的制備

        稱取50g魚腥草,用500ml水浸泡24h,用武火燒開后文火煎煮30min,用紗布過濾;濾渣加水武火燒開后用文火煮30min,用紗布過濾。將兩次濾液合并文火濃縮至50ml。濃縮液先用1500r/min離心10min,棄去沉淀上清液加入3%醋酸殼聚糖溶液,邊加邊攪拌,100r/min,然后將藥液50℃水浴12h,離心取上清液。最后用生理鹽水定容到50ml,配成1:1的中藥溶液。

        1.2.3 藥物對(duì)雞胚安全濃度試驗(yàn)

        將魚腥草提取液依次作2倍稀釋,接種于10日齡雞胚尿囊腔內(nèi),每個(gè)稀釋度接種0.2ml/枚,作4個(gè)重復(fù),同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照。置37℃恒溫箱內(nèi)孵化,棄去24h內(nèi)死亡胚,活胚繼續(xù)孵化直至出雛。

        1.2.4 魚腥草在雞胚內(nèi)抗NDV活性試驗(yàn)

        將魚腥草中草藥提取液用無菌生理鹽水配制成含生藥1g/ml的藥液,然后依次做2倍稀釋(即1:2、1:4、1:8倍的稀釋)滅菌后進(jìn)行如下試驗(yàn):

        第一種加藥方式:不同稀釋度魚腥草提取液與等量100EID50病毒液混合后,將混合液接種于10日齡雞胚,每個(gè)稀釋度5枚,0.2ml/胚,37℃恒溫培養(yǎng)48h,測定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)。

        第二種加藥方式:將不同稀釋度魚腥草提取液接種于10日齡雞胚,每個(gè)稀釋度5枚,0.2ml/枚,37℃恒溫培養(yǎng)2h,然后接種100EID50病毒液0.2ml/,37℃恒溫培養(yǎng)48h,測定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)。

        第三種加藥方式:先將100EID50病毒液液接種于5枚10日齡雞胚,37℃恒溫培養(yǎng)2h,再將不同稀釋度魚腥草提取液接種各胚,每個(gè)稀釋度5枚,0.2ml/枚,37℃恒溫培養(yǎng)48h,測定雞胚尿囊液的血凝效價(jià)。

        以上試驗(yàn)同時(shí)設(shè)立病毒及生理鹽水對(duì)照。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        采用Minitab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,分析各組差異。

        2 結(jié)果

        2.1 NDV對(duì)雞胚半數(shù)感染量(EID50)測定結(jié)果

        記錄不同稀釋度的病毒液HA試驗(yàn)陽性數(shù)和陰性數(shù),按照Reed-Muench方法,計(jì)算NDV毒株的EID50為10-4.375/0.2ml。

        2.2 魚腥草對(duì)雞胚安全濃度試驗(yàn)結(jié)果

        注射不同稀釋濃度魚腥草提取液的雞胚均正常孵化成雛,說明魚腥草對(duì)雞胚無毒性。

        2.3 魚腥草抗NDV活性試驗(yàn)的結(jié)果

        2.3.1 NDV和魚腥草同時(shí)注入雞胚試驗(yàn)結(jié)果

        表2-1 NDV和魚腥草同時(shí)注入雞胚血凝效價(jià)的測定結(jié)果

        NDV和魚腥草同時(shí)注入雞胚時(shí),魚腥草原液血凝效價(jià)較病毒對(duì)照組血凝效價(jià)差異極顯著(p<0.01);魚腥草21倍稀釋液血凝效價(jià)較病毒對(duì)照組血凝效價(jià)差異顯著(p<0.05);魚腥草22倍稀釋液和23倍稀釋液血凝效價(jià)較病毒對(duì)照組血凝效價(jià)差異不顯著(p>0.05)。

        2.32 魚腥草NDV接種后注入雞胚試驗(yàn)結(jié)果

        表2-2 魚腥草于NDV接種后注入雞胚血凝效價(jià)的測定結(jié)果

        魚腥草于NDV接種后注入雞胚時(shí),魚腥草21倍稀釋液血凝效價(jià)較病毒對(duì)照組血凝效價(jià)差異極顯著(p<0.01);魚腥草原液和22倍稀釋液血凝效價(jià)較病毒對(duì)照組血凝效價(jià)差異顯著(p<0.05);魚腥草23倍稀釋液血凝效價(jià)較病毒對(duì)照組血凝效價(jià)差異不顯著(p>0.05)。

        2.33 魚腥草先于NDV注入雞胚試驗(yàn)結(jié)果

        表2-3 魚腥草先于NDV注入雞胚血凝效價(jià)的測定結(jié)果

        魚腥草先于NDV注入雞胚時(shí),魚腥草22倍稀釋液和23倍稀釋液血凝效價(jià)較病毒對(duì)照組血凝效價(jià)差異極顯著(p<0.01);魚腥草21倍稀釋液血凝效價(jià)較病毒對(duì)照組血凝效價(jià)差異顯著(p<0.05);魚腥草原液血凝效價(jià)較病毒對(duì)照組血凝效價(jià)差異不顯著(p>0.05)。

        4 討論

        新城疫病毒可在雞胚中增殖,并釋放到尿囊液中。新城疫病毒在一定條件下能使雞紅細(xì)胞發(fā)生肉眼可見的血凝現(xiàn)象。如在雞胚內(nèi)注入藥物后,尿囊液不出現(xiàn)血凝現(xiàn)象,則表示藥物在雞胚內(nèi)對(duì)新城疫病毒具有明顯抑制作用[8]。魚腥草為三白科植物蕺菜的全草,具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效,對(duì)多種細(xì)菌、病毒具有較強(qiáng)的抑制作用。研究顯示,魚腥草具有抑制流感病毒活性作用,魚腥草抗流感病毒作用的有效成分為其揮發(fā)油,作用機(jī)制是通過干擾病毒包膜而殺滅流感病毒[9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,魚腥草提取液和NDV同時(shí)加入、先加入魚腥草提取液后接種NDV及先接種NDV后加入魚腥草提取液的雞胚都現(xiàn)出了血凝減輕的現(xiàn)象,這可能是魚腥草揮發(fā)性成分發(fā)揮了抗病毒作用,抑制了NDV在雞胚內(nèi)的增殖。

        本試驗(yàn)中,病毒和中藥同時(shí)加入雞胚的目的是觀察藥物對(duì)病毒的直接抑制作用;先接種病毒后加中藥目的是觀察藥物能否對(duì)已進(jìn)入雞胚內(nèi)的病毒起作用,抑制其生物合成及成熟釋放;先加中藥后接種病毒目的是觀察藥物能否與侵入。結(jié)果顯示,三種不同加藥方式的雞胚尿囊液都出現(xiàn)了血凝減輕的現(xiàn)象,表明魚腥草提取液在雞胚內(nèi)既能直接抑制NDV增殖,又能阻止NDV的吸附,同時(shí)也能抑制NDV的生物合成及成熟釋放。

        本試驗(yàn)中,病毒和中藥同時(shí)加入雞胚時(shí),藥液的濃度越高抗病毒活性越好;先接種病毒后加中藥時(shí),21倍稀釋和22倍稀釋的藥液抗病毒活性更好;先加中藥后接種病毒時(shí),抗病毒活性由弱到強(qiáng)依次為原液、21倍稀釋、22倍稀釋、23倍稀釋。結(jié)果表明,魚腥草提取液在雞胚內(nèi)抗新城疫病毒活性與其加藥方式及深度有關(guān)。

        [1]甘孟侯.中國禽病學(xué).北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999

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