郭新慶,郭力,郭新明,孫思習(xí),薛愛琴,劉勝,王海蓉,梁邦領(lǐng),吳穹,

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校,山東 菏澤 274000;1河北醫(yī)科大學(xué);2附屬菏澤市立醫(yī)院;3青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

Hemin對全腦缺血大鼠海馬遲發(fā)型神經(jīng)元死亡的影響

郭新慶,郭力1,郭新明2,孫思習(xí),薛愛琴,劉勝,王海蓉,梁邦領(lǐng),吳穹3,

(菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校,山東 菏澤 274000;1河北醫(yī)科大學(xué);2附屬菏澤市立醫(yī)院;3青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的觀察Hemin對全腦缺血大鼠海馬遲發(fā)型神經(jīng)元死亡的影響。方法24只雄性Wistar大鼠采用4血管閉塞法制造大鼠全腦缺血或再灌注模型,低、高劑量的Hemin于腦缺血后給藥,硫堇染色下對海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的遲發(fā)型死亡(DND)進(jìn)行評估。結(jié)果全腦缺血再灌組CA1區(qū)發(fā)生明顯DND。低高劑量Hemin治療組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元DND與全腦缺血或再灌組相比未見明顯改善(P＞0.05)。結(jié)論治療性給予Hemin不能有效發(fā)揮對全腦缺血或再灌注大鼠海馬的神經(jīng)保護(hù)作用。

神經(jīng)保護(hù);Hemin;全腦缺血;大鼠;遲發(fā)型神經(jīng)元死亡

腦缺血將會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,臨床上處理的原則是盡早恢復(fù)血流再灌注,使缺血的腦組織重新得到氧的供應(yīng),以期恢復(fù)腦功能。然而血流灌注在一定條件下不僅不能改善腦功能,反而進(jìn)一步加重了組織損傷和神經(jīng)功能障礙的程度,稱為缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,I/R)。Hemin(C34H32ClFeN4O4)是一種用于治療貧血的藥物,近年研究表明,Hemin在腦缺血缺氧損傷中具有保護(hù)作用[1-3]。但Hemin對全腦缺血或再灌注后海馬遲發(fā)型神經(jīng)元死亡有何影響,國內(nèi)未見報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)利用大鼠四血管閉塞全腦缺血再灌模型[4],觀察Hemin對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元遲發(fā)型神經(jīng)元死亡的影響,從而對治療性給予Hemin能否對抗全腦缺血或再灌注后海馬的損傷作出評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與程序 健康雄性Wistar大鼠24只,體重270～320g,由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前3d將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于墊料覆蓋籠底的鼠籠內(nèi),給予充足的水和飼料,待動(dòng)物適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后開始實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物均首先凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈,2d后選用恢復(fù)良好的動(dòng)物用于實(shí)驗(yàn)。將凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈的動(dòng)物隨機(jī)分為3組:1)假手術(shù)組(sham)(n=6):行全腦缺血的sham手術(shù),即只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈,不阻斷血流。2)全腦缺血或再灌注組(I/R)(n=6):全腦缺血8min后恢復(fù)血液再灌流,其它同sham組。3)Hemin干預(yù)組(hemin therapy)(n=12):全腦缺血8min恢復(fù)血液再灌流后即刻和24h分別腹腔注射Hemin,共2次。根據(jù)Hemin的劑量進(jìn)一步分為30μ mol/kg 、60μ mol/kg 2個(gè)亞組 。 其它同 I/R 組 。

每組動(dòng)物于sham手術(shù)或腦缺血后7d取材,采用光鏡觀察海馬組織學(xué)分級(jí)(histological grade,HG)及神經(jīng)元密度(neuronal density,ND)。

1.2 試劑 Hemin購于美國 Sigma公司,先用NaOH溶解Hemin,再用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)PH值至7.4溶液,濃度為20μ mol/ml。硫堇(分析純)購于美國Sigma公司。

1.3 大鼠全腦缺血模型的建立 采用四血管閉塞法制造大鼠全腦缺血模型[4]。所有動(dòng)物均首先進(jìn)行雙側(cè)椎動(dòng)脈凝閉,方法如下:10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉下,自雙耳前緣連線中點(diǎn)向尾側(cè)切口約1.5cm,分離頸旁肌暴露第一頸椎橫突,在體視顯微鏡下尋找翼狀孔,將預(yù)熱的尖端直徑約0.5mm的電烙針插入,凝閉雙側(cè)椎動(dòng)脈。術(shù)后供以水、食,2d后選用恢復(fù)良好的動(dòng)物制作全腦缺血模型。首先在乙醚吸入麻醉下,游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,待動(dòng)物清醒后夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈進(jìn)行全腦缺血。夾閉頸總動(dòng)脈期間,大鼠瞳孔散大,翻正反射消失,表明大鼠產(chǎn)生了全腦缺血。Sham手術(shù)包括以上所有步驟,但不夾閉頸總動(dòng)脈。手術(shù)及全腦缺血過程中,創(chuàng)口局部施與局麻藥(1%普魯卡因)防止疼痛;室溫保持在20℃以上;用白熾燈照射動(dòng)物以維持其肛溫在37℃左右,直到恢復(fù)活動(dòng)。全腦缺血后縫合創(chuàng)口,局部施與慶大霉素預(yù)防感染。

1.4 腦組織病理學(xué)評價(jià) 在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)將動(dòng)物迅速斷頭取腦,冠狀切取視交叉后1mm至4mm腦組織,將所取標(biāo)本置于4%多聚甲醛固定液中固定48h,然后0.1mol/L PB洗滌3次,共120min;梯度酒精(70%～100%)脫水共 20～30h;二甲苯透明20～40min,60℃石蠟浸潤 4～4.5h,石蠟包埋。將所取腦組織標(biāo)本常規(guī)腦組織切片(5μ m厚),撈于APES玻片上,60℃干燥箱干燥24h,硫堇染色觀察海馬組織學(xué)改變。參照Kitagawa和Kato方法[5],于光學(xué)顯微鏡下,根據(jù) DND的程度,確定組織學(xué)分級(jí)(Histological grade,HG)和神經(jīng)元密度(neuronal density,ND),對海馬CA1區(qū)組織學(xué)改變進(jìn)行評價(jià)。1)HG:0級(jí),無神經(jīng)元死亡;1級(jí),散在神經(jīng)元死亡;2級(jí),成片神經(jīng)元死亡;3級(jí),幾乎全部的神經(jīng)元死亡。取雙側(cè)平均等級(jí)作為統(tǒng)計(jì)值。2)ND:計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)每1mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目,每張切片雙側(cè)海馬各計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)段取平均值作為統(tǒng)計(jì)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)的處理應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(one way ANOVA)及t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較;組織學(xué)分級(jí)采用多樣本等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)結(jié)果 sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊,無細(xì)胞缺失,細(xì)胞形態(tài)完整,胞核大而圓,位于細(xì)胞中央,核仁清晰,尼氏體豐富,組織學(xué)分級(jí)(HG)為0～1級(jí)。I/R組中,可見明顯的組織損傷,表現(xiàn)為海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞稀疏,排列紊亂;殘存的錐體細(xì)胞體積縮小,呈三角形或不規(guī)則形;核膜不完整,染色質(zhì)碎裂,核仁消失;其周圍可見大量細(xì)胞碎片;與sham組比較,HG(2～3級(jí))顯著升高(P＜0.05)。Hemin治療組中,無論是 30umol/kg、還是60μ mol/kg劑量組,海馬CA1區(qū)均出現(xiàn)明顯的遲發(fā)型神經(jīng)元死亡,HG(2～3級(jí))與I/R組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),見表 1。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度結(jié)果 sham組大鼠海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元密度(ND)為179.17±6.07(cells/mm)。I/R組中,可見明顯的組織損傷,ND為30.99±6.64(cells/mm)。Hemin治療組中,海馬CA1區(qū) ND分別為33.22±5.58(30μ mol/kg 組)、39.23±5.30(60μ mol/kg 組),與 I/R 組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

表1 各組大鼠海馬 CA1區(qū)組織學(xué)分級(jí)結(jié)果(μ mol/kg)

3 討論

海馬組織對缺血性損傷十分敏感,尤其是CA1區(qū)錐體神經(jīng)元[6]并且腦缺血或再灌注時(shí)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元會(huì)發(fā)生細(xì)胞死亡,而其他神經(jīng)元卻不易受到破壞。這種現(xiàn)象在缺血或再灌注后3～4d出現(xiàn),7d左右逐漸完全,故稱為遲發(fā)型神經(jīng)元死亡[7],因此,本實(shí)驗(yàn)選擇觀察腦缺血或再灌注后7d海馬CA1區(qū)損傷變化。本實(shí)驗(yàn)顯示:大鼠全腦缺血8min導(dǎo)致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度下降,發(fā)生明顯的錐體神經(jīng)元DND,結(jié)果與Sun等[8]研究一致。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) 30μ mol/kgHemin治療性給藥沒有發(fā)揮對大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用,結(jié)果與 Takizawa等[9]研究結(jié)果相似,而大劑量60μ mol/kg Hemin治療性給藥也不能減輕全腦缺血打擊引起的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND,這表明全腦缺血后應(yīng)用Hemin不能有效發(fā)揮對大鼠全腦缺血模型海馬的神經(jīng)保護(hù)作用。

總之,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),Hemin治療性給藥不能有效發(fā)揮對全腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)作用,而預(yù)防性給予Hemin能否對海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元產(chǎn)生有效保護(hù)作用,還有待于進(jìn)一步研究。

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The effect of hemin on the CA1neurons in the hippocampus of rats with global cerebral ischemia

GUO Xin-qing,etal
(Heze medical school,Shan Dong Heze,27400,China)

ObjectiveThe study was undertaken to investigate the effect of heminon the CA1neuronsin the hippocampusof rats with global cerebral ischemia.Methods24male Wistar rats were randomly divided into 3groups.Globalbrain ischemia was produced by the fourvesselsocclusion method.The death of neurons was examined with neuropathological evaluation under thionin staining.ResultsThere was obvious DND in the CA1area of the global brainischemia group.Compared with the global brain ischemia group,Hemin therapy group was not any better(P＞0.05).ConclusionThe results suggested that therapeutic administration of Hemin in any dosesused had no protective effect on hippocampus of rats with global cerebral ischemia.

Neuronal protective effect;Hemin;Global brain ischemia;Rats;Delayed neuron death

R338.1;R743.31

A

1008-4118(2010)02-0001-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2010.02.01

2010-03-02